玉米赤黴烯酮(Ⅱ型)ELISA檢測試劑盒說明書（shū）

【概要（yào）】

玉米赤黴烯酮(Zearaleaone)又稱F-2毒素，是玉米赤黴菌的代謝（xiè）產物，具有雌激素樣作用，具有（yǒu）較強的生殖毒性和致畸作用，可引（yǐn）起動物發生雌激素亢進症，導致動物不孕或流（liú）產，對家禽（qín）、豬、牛和羊的影（yǐng）響較大，給畜（chù）牧業帶來很大的經（jīng）濟損失。

【適用範（fàn）圍】

可定性、定量檢測穀（gǔ）類、飼料及其原料等樣本中的玉（yù）米赤黴烯酮殘留量。

【試驗原理】

本（běn）試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板（bǎn）上預包被玉米赤黴烯酮抗原，加（jiā）入樣本/玉米（mǐ）赤黴烯酮標（biāo）準品溶液及辣根（gēn）過氧化物酶標（biāo）記（jì）的玉（yù）米赤黴烯（xī）酮抗體。樣本或標準品溶液中的玉米赤黴烯酮與預包被在微孔板（bǎn）上的（de）玉（yù）米赤黴烯酮抗原競爭結合辣根過氧化物（wù）酶標記的玉米赤黴烯酮抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸（xī）光值與其所含殘留物玉米（mǐ）赤黴烯酮抗原的含量成負相關。對照標準曲線，即可得（dé）出相應殘留物玉（yù）米赤黴烯酮的含量。

【試（shì）劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：20ppb

【交叉（chā）反應率】

   結構類似物（wù）                                                            交叉反應（yīng）率

  玉米赤黴烯酮   ……………………………………………………………  100%

  α-玉米赤黴醇  ……………………………………………………………   75%

  β-玉米赤黴醇   ……………………………………………………………   61%

  α-玉米赤黴烯醇  …………………………………………………………  103%

  β-玉米赤黴烯（xī）醇（chún）  ……………………………………………………………  83%

  玉米赤黴酮   …………………………………………………………………  75%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準（zhǔn）液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 20ppb, 40ppb, 80ppb, 240ppb, 720ppb

3. 酶標物 1瓶  ………………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶  ………………………………………… 12ml

5. 終止液（yè）1瓶  ………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗（xǐ）滌液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×） 1瓶………………… 20ml

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅粉碎機

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移（yí）液器：單道（dào） 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl

試劑：

-----甲醇

----去離（lí）子水（或蒸餾水）

【試劑配製】

1. 樣品稀釋（shì）液：將（jiāng）濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積（jī）比進行稀釋（1份濃縮（suō）樣品稀釋液+9份去（qù）離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份（fèn）濃縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 70％甲醇：取無水甲醇，用去離子水以7:3體積比例稀釋（7份無水甲醇＋3份水）

【樣本前處理步驟】

花生醬、芝麻醬、蛋黃醬、麵粉、餅幹、蛋糕等（děng）食品，各種飼（sì）料及花生粕、豆粕（pò）、麥（mài）麩、DDGS等原料（稀釋倍數：5）

1. 取10g粉碎的（de）樣品與50ml 70%甲醇水混合均勻（可根據提（tí）取容器，等比例適量調整）；

2. 高速（sù）均質2min或振蕩提取5min；

3. 2000g離心（xīn）5min或定性濾紙過濾；

4. 取100μl上清液待測。

【檢測（cè）步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之（zhī）前將所有試劑（jì）和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板條（tiáo）放置2～8℃，幹燥環境保存（cún）有利於保持試劑穩定性。

3. ELISA分析中的再現性，很大程度上取決（jué）於洗板（bǎn）的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光（guāng）線照（zhào）射。用蓋板膜封住（zhù）微孔板。

二、操作步驟：

1. 將（jiāng）所需試劑及微孔（kǒng）板取（qǔ）出，放置室（shì）溫（20～25℃）30min以（yǐ）上，液體試劑使用前均須（xū）搖勻。

2. 取出所需數量（liàng）的微孔板，將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封，放置（zhì）於2～8℃。不（bú）可冷凍。

3. 洗（xǐ）滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標準品對應微孔編號（hào），每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的（de）位置。

5. 每孔（kǒng）中加入（rù）60μl樣品稀釋液。

6. 加標準品/樣本30μl到對應的（de）微孔中（zhōng），加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板（bǎn）後（hòu）置室溫避光反應15min。

7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗（xǐ）滌，300μl/孔，洗板5次，每（měi）次間隔30s，用吸水（shuǐ）紙拍（pāi）幹。

8. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應15min。

9. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設（shè）酶標儀於450nm處讀取每孔OD值。

【結果判定】

1. 百分吸光率的計算

標準品或樣本的百分吸光率等於（yú）標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（zhí）（雙（shuāng）孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分（fèn）吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或樣本（běn）溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

2. 標準曲線的（de）繪製與計算

以標準品百分（fèn）吸光率為縱坐標，玉米赤黴烯酮標準品濃度（ppb）的對數為（wéi）橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本（běn）的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其（qí）對應的稀釋倍數即為樣本中玉米赤黴烯酮實際含量。

【注意事項（xiàng）】

1. 室溫低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過（guò）程中如果出（chū）現板孔幹燥的情（qíng）況，則會出現標準曲線不成線性，重複性不好（hǎo）的現（xiàn）象。所以洗板拍幹（gàn）後應立即進行下一步操作（zuò）。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮（pí）膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的（de）試劑（jì）盒；不要交換使用不（bú）同批號試劑盒（hé）中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒（hé）保存於2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無色的（de）顯色劑對光（guāng）敏感，因此要（yào）避光保（bǎo）存。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑有任何顏色表（biǎo）明顯（xiǎn）色劑變質，應當（dāng）棄（qì）之。0標準的吸光度（dù）（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時（shí），表示試劑可能變質。

8. 加入（rù）顯色液後，一般（bān）顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可（kě）延長反應時間到35min（或更長（zhǎng）），但不得超過40min。反之，則減短反應時間。

9. 該試劑盒最（zuì）佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度（dù）發生變化。

【樣品最低檢測限】

    飼料………………………………………………200ppb

【貯藏條件及（jí）保存期】

貯（zhù）藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。