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玉米赤黴烯酮(Ⅰ型)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
玉米赤黴烯(xī)酮(tóng)(Zearaleaone)又稱F-2毒素,是玉米赤黴(méi)菌的代謝產物,具有雌激素樣作用,具有較強的生殖毒(dú)性(xìng)和致畸作用(yòng),可引起動物發生雌激素亢進症,導致動物不孕或流產,對(duì)家禽、豬、牛和羊的影(yǐng)響較大(dà),給畜(chù)牧業帶來很大(dà)的經濟損(sǔn)失(shī)。
【適用範圍】
可(kě)定性、定量檢測穀類、啤酒及飼料等樣本中的玉(yù)米赤黴烯酮(tóng)殘留量。
【試驗原(yuán)理】
本試劑盒采用競爭ELISA,在微(wēi)孔板上預包(bāo)被玉米赤(chì)黴烯酮抗原,加入樣本(běn)/玉米赤黴烯酮標準品溶(róng)液及辣根(gēn)過(guò)氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮抗體。樣本或標準品溶液中的玉米赤黴烯酮與預包被在微孔板上的(de)玉米(mǐ)赤(chì)黴烯酮抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的玉米赤黴烯酮抗體。未(wèi)結合的酶標抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色,讀(dú)取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物玉米(mǐ)赤黴烯酮抗原的含量成負相關。對照標準曲線,即可得出相(xiàng)應殘留物玉米赤黴烯酮的含量。
【試劑盒靈(líng)敏度(dù)】
試劑盒靈敏度(dù):0.2ppb
【交叉反(fǎn)應率】
結構類似物 交叉反(fǎn)應率
玉米赤黴烯酮(tóng) …………………………………………………………… 100%
α-玉米赤黴醇 …………………………………………………………… 75%
β-玉米赤(chì)黴醇 …………………………………………………………… 61%
α-玉(yù)米赤黴烯(xī)醇 ………………………………………………………… 103%
β-玉米赤黴烯醇 …………………………………………………………… 83%
玉米赤黴酮 ………………………………………………………………… 75%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標準液×6瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.2ppb, 0.6ppb, 1.8ppb, 5.4ppb, 16.2ppb
3. 酶(méi)標物 1瓶 ………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液(yè) (10×)1瓶 ……………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液(10×) 1瓶………………… 20ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備:
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅粉碎機
┅┅離心機
┅┅天平:感量0.01g
┅┅微量移液器:單道 20μl~200μl、200μl~1000μl、多道 300μl
試劑:
-----甲醇
----去離子水(或蒸餾水)
【試劑配製】
1. 樣品稀釋(shì)液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進行稀釋(1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水(shuǐ))。
2. 洗滌工作液:將濃縮洗(xǐ)滌(dí)液用去離子水按1:9體積比進行稀釋(1份濃縮洗滌液+9份去離子水)。
3. 50%甲醇:取無水甲醇,用去離子水(shuǐ)以1:1體積比例稀釋(1份無水甲醇+1份水)。
4. 40%甲醇:取無水甲醇(chún),用去離(lí)子水以4:6體積比例稀釋(4份無水甲醇+6份水)。
【樣本前處理步驟】
一、 穀物(稀釋倍數:10)
1. 取1g粉碎樣品,加入4ml 50%甲醇;
2. 劇烈振蕩5min;
3. 4000g離心(xīn)5min;
4. 取上清(qīng)液400μl,加入600μl樣本稀釋液,混勻(yún);
5. 取稀釋後液體(tǐ)待(dài)測。
二、啤酒(稀釋倍數:10)
1. 取待測啤酒,除淨氣體(60℃水浴或振蕩去除);
2. 取1ml啤酒,加入4ml40%甲(jiǎ)醇;
3. 劇烈振蕩5min;
4. 取上述液體500μl,加入樣(yàng)本稀(xī)釋液500μl,混勻;
5. 取稀釋後液體待測。
三、飼料(稀釋倍數:200)
1. 取0.5g粉(fěn)碎樣本,加入20ml無水甲醇;
2. 充分振(zhèn)蕩5min;
3. 5000rpm離心5min;
4. 取上清液100μl加入樣本稀釋液400μl混勻;
5. 取稀釋後液體待(dài)測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知:
1. 使(shǐ)用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板(bǎn)條放置2~8℃,幹燥環境保存有利於保持試劑穩定性。
3. ELISA分析中的再現性,很大程度上取決於(yú)洗板的一致性,正確(què)的洗(xǐ)板操作是ELISA操作中的要點。
4. 在所(suǒ)有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用(yòng)蓋板膜封住(zhù)微孔板。
二、操作步驟(zhòu):
1. 將所需試劑及微(wēi)孔板取出(chū),放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前(qián)均須搖(yáo)勻。
2. 取出所需數量的微(wēi)孔板,將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封,放置於2~8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標準品對應微孔編(biān)號,每個樣本(běn)和標準品做2孔平行(háng),並記錄標準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加(jiā)標準品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中,加入(rù)酶標物50μl/孔,輕輕振蕩(dàng)混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應15min。
6. 小心揭(jiē)開蓋板膜,用洗滌工作液充分(fèn)洗滌,300μl/孔,洗板(bǎn)5次,每次間隔30s,用吸水紙拍幹。
7. 加入顯色液100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光(guāng)反應15min。
8. 加(jiā)終止(zhǐ)液50μl/孔,輕(qīng)輕振蕩(dàng)混勻,設(shè)酶(méi)標儀於450nm處讀取每孔OD值(zhí)。
【結果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準品或樣本的(de)百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(zhí)(雙(shuāng)孔(kǒng))除以第一個標準(zhǔn)(0標準)的吸光度(dù)值,再(zài)乘以100%,即
百分吸光率(%)= B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸(xī)光(guāng)度值
B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪製(zhì)與計算(suàn)
以標準品百分吸光(guāng)率為縱坐(zuò)標,玉(yù)米赤黴烯酮標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標,繪製標準(zhǔn)曲線圖。將(jiāng)樣本的(de)百分吸(xī)光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所(suǒ)對應的濃度,乘以其對應的稀釋