嘔吐毒素（DON）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要（yào）】

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔（ǒu）吐毒素(vomitoxin)，主要是由鐮刀菌的某些產生的化學（xué）結構（gòu）和生物活性相似的有毒代謝產物——單端孢黴烯族化合物中的一種。DON 的主要產生菌是禾穀（gǔ）鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，主要汙（wū）染小麥、大麥、玉（yù）米等穀類作物（wù），也汙（wū）染糧食製品，人和動物在誤食被該毒素汙染的糧穀類後可以產生廣（guǎng）泛的毒性效應。近年來發現DON可能與人類食管癌、IgA腎病有關。DON屬於劇毒或（huò）中等毒物，人畜攝入了被DON汙染的食物/飼料後，會導致厭食（shí）、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩、反（fǎn）應遲鈍等急性中毒症狀，嚴（yán）重時損害造血係統造成死亡。研究表明（míng），DON可能對免疫係統有影響，有明顯（xiǎn）胚胎毒性和一（yī）定致畸作用，可能有遺傳毒性（xìng），但無致癌、致突變作用。穀物及飼料中DON的含量有嚴格的限量標準。我國（guó）穀物中DON 的限量標準為（wéi）1．0 mg／kg 。因此，有必要對其進行有效的監控。HPLC或GC-MS用作檢測嘔吐毒素的方法（fǎ），但是其（qí）前處理（lǐ）步驟繁瑣，費用昂貴。酶聯免疫檢測試劑（jì）盒則可經濟、快（kuài）速地檢測嘔吐毒素。

【適用範圍】

本試劑盒可定性、定量測定大米（mǐ）、小米、小麥等穀物及飼料中的嘔吐毒素。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預包（bāo）被嘔吐毒素抗原，加入樣本/嘔吐毒素標準品溶液及辣根（gēn）過氧（yǎng）化物酶標記的嘔吐毒素抗體。樣本或（huò）標（biāo）準品溶液（yè）中的嘔吐毒素與預包被在板孔上（shàng）的嘔吐毒素抗原競爭結合辣根過（guò）氧（yǎng）化物酶標記的（de）嘔吐毒素抗體，未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物（wù）嘔吐毒素抗原的含量成負相關（guān）。對照標準曲線，即可得出相應殘留物嘔吐毒素的含（hán）量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈（líng）敏度：3ppb

【交叉反應率】

   結構類似物                                                              交叉（chā）反應（yīng）率

  脫（tuō）氧雪腐鐮刀菌烯（xī）醇  ……………………………………………………  100%

  3-乙酰基（jī）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇   ………………………………………   15%

  15-O-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（chún）   ……………………………………   11%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標（biāo）準液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 36ppb,72ppb

3. 酶標（biāo）物1瓶   …………………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶   ……………………………………………12ml

5. 終止液1瓶   ……………………………………………10ml

6. 濃（nóng）縮洗滌液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（20×）1瓶……………………… 40ml

【需要而未提供的設備】

----微孔板酶標（biāo）儀450nm/630nm

----振蕩器

----離心機

----粉碎機

----天平：感量0.01g

----微量移液器：單道 20ul～200μl、200μl～1000μl、多（duō）道 300μl

【試劑配製】

1. 洗滌工（gōng）作液：將（jiāng）濃縮洗滌液用去（qù）離子（zǐ）水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

2. 樣品稀（xī）釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:19體積比進行稀（xī）釋（1份濃縮樣品提取（qǔ）液+19份去離子（zǐ）水）。

【樣本前處理步驟】

一、大米、小米、麵（miàn）粉等穀物及飼料Ⅰ（稀釋倍數：50）

1. 取0.1g粉（fěn）碎好的樣品，加入5ml樣品稀釋液，混勻；

2. 充分振蕩10min；

3. 4000g室溫離心10min；

4. 取100μl上（shàng）清液體待測。

二、大米、小米、麵粉等（děng）穀物及飼料Ⅱ（稀釋倍數：50）

1. 取20g粉碎好的樣品，加入100ml水，混勻；

2. 充分振蕩（dàng）10min；

3. 4000g室溫離心10min或定性（xìng）濾紙過濾；

4. 取50μl上清液體，加（jiā）入450μl樣品（pǐn）稀釋液，混勻；

5. 取100μl上清液體待測。

【檢測（cè）步驟】

一、 測定前須（xū）知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板（bǎn）條回溫（wēn）（20～25℃）。

2. 使用之後立即將（jiāng）所有試劑（jì）及剩餘板條放置2～8℃，幹燥環境保存有（yǒu）利於保持試劑穩定性。

3. ELISA分析中的再現性，很（hěn）大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作（zuò）中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照（zhào）射，用蓋板膜封住微孔板（bǎn）。

二、操作（zuò）步驟：

1. 將所（suǒ）需試劑及微孔板取出，放（fàng）置室溫（20～25℃）30min以（yǐ）上，液體試劑（jì）使用前均須搖勻。

2. 取出所需數量的微孔板（bǎn），將不用的（de）微孔板與幹燥劑一起重新真（zhēn）空密封，放置於2～8℃。不可冷（lěng）凍。

3. 洗滌（dí）工作液在使用前也需（xū）回溫。

4. 將樣（yàng）本和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並（bìng）記錄標準孔和（hé）樣本孔所在的位置。

5. 加標準品/樣本50μl到對應的（de）微孔中，加入酶（méi）標物50μl/孔，輕輕振（zhèn）蕩混勻，用蓋板膜蓋板後（hòu）置室溫避光反應15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸（xī）水（shuǐ）紙拍幹。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室（shì）溫避光反應15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶標儀於450nm處讀取每（měi）孔OD值。

【結果（guǒ）判定】

1. 百分吸光率的計算

標（biāo）準品或樣（yàng）本的百分吸光率等於標準品或樣本（běn）的百分吸光度值（zhí）的平均值（雙孔（kǒng））除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或樣本溶液的平均（jun1）吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸（xī）光度值

2. 標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，嘔吐毒素標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的（de）百（bǎi）分吸光（guāng）率代（dài）入標準曲（qǔ）線中，從標準曲線（xiàn）上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中嘔吐毒素實際含量。

【注意（yì）事項】

1. 室溫（wēn）低於20℃或試劑及樣（yàng）本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致所有（yǒu）標準的OD值（zhí）偏低。

2. 在（zài）洗板過程中如果出（chū）現板孔幹燥的情（qíng）況，則會出現標準曲線不成線性（xìng），重複性不（bú）好的現象。所以洗板拍幹後應立即（jí）進行下一步操作。

3. 每種試劑（jì）使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為2M鹽酸，避免接觸（chù）皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使（shǐ）用過了有（yǒu）效期的（de）試劑盒；不要交（jiāo）換使用不（bú）同批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存於2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新（xīn）真空密封。標準物質（zhì）和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光（guāng）保存。

7. 試劑變質的跡象：

顯色試劑有任何（hé）顏色表明顯色劑變質，應（yīng）當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8. 加（jiā）入顯色液後，一般顯（xiǎn）色時間為15～30min。若（ruò）顏色較淺，可延長反（fǎn）應（yīng）時間到35min（或更長），但不得（dé）超過（guò）40min。反之，則減（jiǎn）短反應時間。

9. 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【試劑盒（hé）靈敏度】

    試劑盒靈敏度：3ppb

【樣品最低檢測（cè）限】

    穀物、飼料…………………………………………150ppb

【貯藏條件及保存期（qī）】

貯藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存（cún）期：該產品有效期為12個月。