黃曲黴毒（dú）素總量(Aflatoxin Total)ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

黃（huáng）曲黴毒素是一類真菌（主要是黃曲黴和寄生曲黴（méi））代謝的有（yǒu）毒產物（wù），主要存在於穀物，堅果，棉籽以及一（yī）些與人類血液，動物飼料相關的（de）產品中。黃曲黴毒（dú）素以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2這（zhè）四種毒素為主，黃曲黴毒素總量一般是指這四種毒素的總（zǒng）量。它們是I類致癌物，被證明對人和動物的肝髒（zāng）、腎髒等組織和器官具有很大的危害（hài），是一類毒性很強的致癌物質（zhì）。因此，必須對其進行及時檢測監控，目前主（zhǔ）要的檢測手段是高效液相色譜法。（HPLC）

本產品是基於免疫競爭法檢測原理建立（lì）的（de）一種（zhǒng）快速（sù）定（dìng）量檢測黃曲黴（méi）總量的試劑盒。它具有簡單（dān）、快速，無（wú）需特殊儀器設備等優勢，既可以（yǐ）用於實驗室檢測，也可在農（nóng）場、飼料混合車間等進行實地（dì）測定。

【適用範圍】

可（kě）定性、定量檢測玉米、大（dà）米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲黴（méi）毒素總量。

【試驗原理】

本試劑盒采用競（jìng）爭ELISA，在微（wēi）孔板上（shàng）預包被黃曲黴毒素抗原，加入（rù）樣本/黃曲黴毒素總量標準品溶液及辣根過（guò）氧化物酶標記（jì）的黃曲（qǔ）黴毒素總量抗體。樣本或標準品溶（róng）液中的黃曲黴毒素與預包被在微孔板上的黃曲黴毒素抗原競（jìng）爭結合辣根過氧化物酶標記的黃曲黴（méi）毒（dú）素總量抗體。未結合（hé）的酶標抗體（tǐ）在洗滌時（shí）被除去，再（zài）加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲黴（méi）毒素總量的含量成負相關。對照標準曲線，即（jí）可得出相應殘（cán）留物黃曲黴毒素總量的含量。

【試劑盒靈（líng）敏度】

   試劑（jì）盒靈敏度：0.1ppb

【交叉反應率】

   結構類似物（wù）                                                               交叉反應率

  黃曲黴毒素B1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲黴（méi）毒素B2   ……………………………………………………………   75%

  黃曲黴毒素G1   ……………………………………………………………  100%

  黃曲黴毒（dú）素G2   ……………………………………………………………   97%

  黃曲黴毒素M1  ……………………………………………………………   30%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液×6瓶（píng）：（2ml/瓶）

    0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

3. 酶標物（wù）1瓶  …………………………………………  6ml

4. 顯（xiǎn）色液（yè）1瓶（píng） …………………………………………  12ml

5. 終止液1瓶  ………………………………………… 10ml

6. 濃（nóng）縮洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀（xī）釋液（10×）1瓶 ……………………50ml

8. 濃縮樣品（pǐn）稀釋液（yè）（10×）1瓶 ……………………25ml

【需要而（ér）未提供的（de）設（shè）備及試（shì）劑】

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅氮吹儀

┅┅粉（fěn）碎機

┅┅離心機

┅┅微量天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道（dào） 20μl～200μl、200μl～1000μl、 多道300μl

試劑：

┅┅甲醇（分析純）

┅┅石油醚

┅┅去離（lí）子水（或蒸（zhēng）餾水）

┅┅乙腈

┅┅NaCl

【試劑配製】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣（yàng）品稀釋液（yè）用去離子水按1:9體積比進行稀（xī）釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液（yè）：將濃縮洗滌液用去離子（zǐ）水按1:9體（tǐ）積比（bǐ）進行稀釋（1份（fèn）濃縮洗滌液+9份去（qù）離子水）。

3. 穀（gǔ）物稀釋液：將0.9gNaCl用配製完成（chéng）的（de）樣品稀釋（shì）液溶解並定容至100ml。

4. 啤酒稀（xī）釋液：取無水甲醇，用配製完成的樣品稀釋液按1:4體積比（bǐ）進行稀釋（1份甲醇+4份樣品稀釋液）。

5. 50%甲醇（chún）：取無水甲醇，用去離子水按（àn）1:1體積比進行稀釋（1份無水甲醇+1份去離子（zǐ）水）。

【樣本前處理步驟】

一、 穀（gǔ）物（大米（mǐ）、玉米、小米等低脂含量）（稀釋倍數：8）

1. 取1.0g粉碎的樣（yàng）品與8ml 穀物稀釋液（yè）混合（hé）均勻；

2. 強（qiáng）力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取上清液（yè）100μl待測。

二、 蛋糕（稀釋倍數：10）

1. 取1.0g粉碎的樣品與4ml 50%甲醇混合（hé）均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 5000g離心10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

5. 取100μl稀釋後液體待測。

三、 花（huā）生、奶油蛋糕（稀釋倍（bèi）數：10）

1. 取1.0g粉碎的（de）樣品與4.0ml石油醚混合均勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混合均勻（yún）；

3. 強力振蕩3min；

4. 5000g離心10min；

5. 取400μl下層（céng）液（yè）體（tǐ），加入600μl樣（yàng）品稀釋液進行稀釋，充分混勻；

6. 取100μl稀釋後液體待測。

四、 食用油（稀釋倍數：10）

1. 取1.0g樣品（pǐn）與4.0ml石油醚混合（hé）均（jun1）勻；

2. 加入4ml 50%甲醇混（hún）合，振蕩1min；

3. 靜置10min；

4. 取400μl下層液體，加入600μl樣品稀釋液進（jìn）行（háng）稀釋，充分混勻；

5. 取（qǔ）100μl稀釋後液體待測。

五、 飼料、麵粉（fěn）、湯圓（yuán）（稀釋倍數：24）

1. 取3.0g粉（fěn）碎的樣品與9.0ml 80%甲醇（chún）混合均勻；

2. 強力振蕩3min；

3. 2000g離心10min；

4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品（pǐn）稀釋液，混合均勻；

5. 取（qǔ）100μl稀釋後液體待（dài）測。

六、 啤酒（稀釋倍數：5）

1. 取200μl啤酒樣品（去除CO2），加入800μl啤酒稀釋液；

2. 振（zhèn）蕩3min；

3. 取100μl稀釋後液體待（dài）測。

七、醬油、醋（cù）、葡萄酒（稀釋倍數：8）

1. 取0.5ml樣品（pǐn），加入0.5ml蒸餾水並加入4.0ml三氯甲烷；

2. 混（hún）勻振蕩3min，5000g離心10min；

3. 取1.0ml下層液，60℃氮氣吹幹；

4. 加（jiā）入100μl乙腈溶（róng）解幹燥物，並加入900μl樣品稀釋液，充分（fèn）混勻；

5. 取100μl稀釋後液體待（dài）測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需（xū）板條回溫（wēn）（20～25℃）。

2. 使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置（zhì）2～8℃，幹燥環境保存有利於保持試劑穩定性。

3. ELISA分析中的再現性，很大程度上（shàng）取決於（yú）洗板的（de）一（yī）致性，正確的洗板操作是ELISA操作（zuò）中的要（yào）點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步（bù）驟：

1. 將所需（xū）試劑及微孔板取出，放（fàng）置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所（suǒ）需數量的微（wēi）孔板，將不用的微孔板與幹（gàn）燥劑一起重新真空密封，放置於2～8℃。不可冷凍。

3. 洗（xǐ）滌工作（zuò）液在使用前也需回溫。

4. 將（jiāng）樣本（běn）和標準品對（duì）應微孔編號，每個樣本（běn）和標準品做2孔平（píng）行，並記（jì）錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標準品/樣（yàng）本50μl到對應的（de）微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避（bì）光反應15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板（bǎn）5次，每次間隔30s，用吸水紙拍（pāi）幹。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板（bǎn）後置室溫避光反應（yīng）15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設（shè）酶標儀於450nm處讀取每孔OD值。

【結果判定（dìng）】

1. 百分吸（xī）光（guāng）率（lǜ）的計算（suàn）

標準（zhǔn）品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙（shuāng）孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘（chéng）以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準（zhǔn）溶液或樣本溶液的平均吸光（guāng）度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

2. 標準曲線的繪製與計算

以標準品百分吸光率（lǜ）為縱坐標，黃曲黴毒素總量標準品濃度（dù）（ppb）的對數為橫坐標，繪（huì）製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀（dú）出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為（wéi）樣本中黃曲黴毒素總量實際（jì）量。

【注（zhù）意（yì）事項】

1. 室溫（wēn）低於20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫（20～25℃）會導致（zhì）所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現板孔幹（gàn）燥的情況（kuàng），則會出現（xiàn）標準（zhǔn）曲線不成（chéng）線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立（lì）即進（jìn）行下一步操作。

3. 每種（zhǒng）試劑使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為（wéi）0.5M硫酸，避（bì）免接觸皮膚（fū）。

5. 不要使用過（guò）了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效（xiào）期（qī）的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑（jì）盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存於2～8℃，不能冷凍（dòng），將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無色的（de）顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質的跡（jì）象（xiàng）：

顯色試劑有（yǒu）任何顏色表明顯色劑變（biàn）質，應（yīng）當（dāng）棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質。

8. 加入顯（xiǎn）色（sè）液後，一（yī）般（bān）顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應時間到35min（或（huò）更長），但不得超過40min。反之，則減短反應時間。

9. 該（gāi）試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低（dī）將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【樣品最低檢測限】

    穀物 ………………………………………………0.8ppb

    蛋糕 …………………………………………………1ppb

    花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb

    食用油 ………………………………………………1ppb

    飼料、麵粉、湯圓………………………………2.4ppb

    啤酒  ………………………………………………0.5ppb

    醬油、醋 …………………………………………0.8ppb

【貯藏條（tiáo）件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒於2～8℃。

保存期：該產品有效期為12個月。