黃曲黴毒（dú）素M1免疫親和柱（zhù）操作說明書

【概要】

黃曲黴毒素（Aflatoxin）是黃曲黴、寄生曲黴（méi）等（děng）真菌產生的（de）次級代謝（xiè）產物，被世界衛生組（zǔ）織（zhī）的（de）癌症研究機構劃分（fèn）為1類致（zhì）癌物，同時又是一種毒性極強的劇毒物質，廣泛存在於各種食物中。玉米（mǐ），花生，大（dà）米，小麥（mài）等（děng）穀物及其副產品是（shì）黃曲黴毒素的（de）主要來源，同時飼料中的黃曲黴毒（dú）素B1經過動物代（dài）謝後產生（shēng）的黃曲黴毒素M1仍然具有很強的毒性和（hé）致癌性，也（yě）廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲黴毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是胃癌，腸癌等疾病的主要原因，對人類的健康構成很大威脅（xié）。世界各國對食品，飼料中的黃曲黴毒（dú）素都有嚴格的限量標準。2010年6月1日開始施行的乳品安全國家標準（zhǔn）中對乳和乳製品中黃曲黴毒素M1的（de）檢測進行了規定，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱淨（jìng）化法。

【適用範圍及性能】

用於定性、定量檢測（cè）牛奶，奶粉，發酵乳，幹酪，奶油等樣品中黃曲黴毒素M1的（de）樣品前處理（lǐ）。

柱（zhù）容量：≥200ng

回收率：≥90%

【試驗原理】

本產（chǎn）品的（de）測定的基礎（chǔ）是抗原抗體反應，黃曲黴毒素M1單克隆抗體連接在柱內凝膠上（shàng），樣品中的黃曲黴毒素M1經過提取、過濾、稀（xī）釋，然後（hòu）將樣品（pǐn）提取液緩慢（màn）的（de）通（tōng）過（guò）黃（huáng）曲黴毒素M1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內，毒（dú）素與抗（kàng）體結合，之後洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的（de）其他物質。用甲醇洗（xǐ）脫黃曲黴毒素M1，然後注入到分（fèn）析儀器中（zhōng）用於檢測。

【包裝組成（chéng）】

根據不同規格，每一個盒中包含（hán）5-25支黃曲黴毒素免（miǎn）疫親和（hé）層析柱（zhù）及1份說明書。

【需要而未提供的設備（bèi）及試劑】

設備：

┅┅高速均質器或組織勻漿機

┅┅粉碎機

┅┅200mL/50mL量筒（tǒng）

┅┅天（tiān）平：感量0.1g

┅┅酸（suān）度計

┅┅分液漏鬥

┅┅微量移液器（qì）：單道 100L～1000L

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性（xìng）或定量濾紙）

┅┅50mL漏鬥

┅┅旋轉蒸發儀

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包（bāo）括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）

┅┅燒杯，容量瓶，錐形瓶等

試（shì）劑：

┅┅甲醇（色譜級）

┅┅乙腈（色譜級）

┅┅石油醚

┅┅蒸餾（liú）水或去離子水

┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱取（qǔ）2g氫氧化鈉溶解於100mL水中

【樣本處（chù）理步（bù）驟】

（一）牛奶

┅┅將（jiāng）100mL牛奶水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離（lí）心15min，收集50mL清澈液待（dài）用（yòng）

（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

┅┅稱取10g奶粉樣品，將100mL50 oC水多次少量（liàng）加入，攪拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min離心15min，收集（jí）50mL清澈液待用

（三）發酵乳(包括固體狀、半固（gù）體狀（zhuàng）和帶果肉型)

┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫（qīng）氧化鈉溶液在酸度（dù）計指示下（xià）調pH至7.4；

┅┅用高（gāo）速均質器在 9500 轉/分鍾下（xià）告訴勻（yún）漿（jiāng）5 min

┅┅水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離（lí）心15min，收（shōu）集50mL清澈液待用

（四）幹酪

┅┅稱取經切細、過10目圓（yuán）孔（kǒng）篩混勻的試樣5g置於50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均質器在 9500r/分鍾下告訴勻漿5 min；

┅┅超聲提取（qǔ）30 min；

┅┅在6000r/分鍾下離心（xīn）15 min，收集上清液並移入250 mL分液漏鬥中。

┅┅在（zài）分液漏鬥中加入（rù）30 mL石油醚（4.3），振搖2 min；

┅┅待分層後，將下層移（yí）於50 mL燒杯中，棄去石油醚層。

┅┅重複用石油醚提取（qǔ）2次；。

┅┅將下層溶液移到100 mL圓（yuán）底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL；┅┅濃縮液倒入離心管中，燒（shāo）瓶（píng）用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一並倒入50 mL離心管中；

┅┅加水稀釋至約（yuē）50 mL，在6000 轉/分鍾下離心 5 min，上清液供淨化處理。

（五）奶油

┅┅稱取5g試樣，置（zhì）於50 mL燒（shāo）杯中（zhōng）；

┅┅用20 mL石油醚將其溶解並移於250mL具塞錐形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振（zhèn）蕩30 min後，將全部液體移於分（fèn）液漏鬥中；

┅┅待分層後，將（jiāng）下層溶液全部移到100 mL圓底燒（shāo）瓶中，在旋（xuán）轉蒸發儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供淨化處（chù）理（lǐ）。

【親和柱淨化步驟】

┅┅將免疫親和柱連接於10.0mL玻璃注射器下。準確移取（qǔ）10.0mL清澈液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵（bèng）與玻璃（lí）注射器連接，調節壓（yā）力使溶液以（yǐ）約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親（qīn）和（hé）柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅在注射器中加入（rù）10ml水，調節壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

┅┅準確加入1mL色譜級乙（yǐ）腈洗脫，流（liú）速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液於（yú）玻璃試管中，供檢測用。

【結果判（pàn）定】

經免疫親和柱淨（jìng）化後，收集到的乙腈（jīng）洗脫液可直接使用熒光計或（huò）者HPLC檢測，也可使用薄（báo）層色譜或者酶聯免（miǎn）疫（yì）試（shì）劑盒進行檢測。收集到的1ml洗脫液中的黃曲黴毒素含量相當於10ml牛奶樣品、發酵乳樣品或者1g奶粉樣品、幹酪樣品和奶油樣品中黃曲黴毒素M1的含量。

如果HPLC檢測需要其它溶劑，可以將乙腈洗脫液氮氣吹幹，然後複溶

【注意事項】

┅┅黃曲黴毒素（sù）危害極大，應戴手套操作。

┅┅使用過（guò）的玻璃容器及（jí）黃曲黴毒素溶液最好用（yòng）5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過夜。

┅┅不要使用過了有效日期的免（miǎn）疫（yì）親和柱。

【貯藏條件及（jí）保存期】

貯藏條件：親和柱可於常溫保存，2-8℃儲（chǔ）存（cún）可延長有效期，不（bú）可凍存。

保存期：該產品有效期為12個（gè）月（yuè）。