傳統的蛋（dàn）白鑒定方法，如（rú）免疫（yì）印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機（jī）體中有意義的基因的過表達（dá）通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選。 目前，所選用的（de）技術包括對於蛋白鑒定的圖象分析（xī）、微量測序、進一步對肽片段進（jìn）行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。

1  圖（tú）象分析技術（Image analysis）

“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的（de）直覺，每一個圖象上（shàng）斑點的上調、下調及出（chū）現（xiàn）、消失，都可能在生理和病理狀態下產（chǎn）生，必（bì）須依靠計算機為基礎的（de）數據處理，進行定量分析。 在一係列高質量的2-DE凝膠產生（低（dī）背景染色，高度的重複性）的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建（jiàn）。 首先，采集圖象通常所用的係統是電荷耦合CCD（charge coupled device）照相機（jī）；激光（guāng）密度儀（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，對圖象（xiàng）進行數（shù）字化。 並成為（wéi）以象素（pixels）為基礎的空間和網格。 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以（yǐ）進行斑點檢測。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意義的區域與背（bèi）景分離（lí），精確限（xiàn）定斑點的強度、麵積、周長和方向。

圖象分析（xī）檢測的（de）斑點須與肉（ròu）眼觀測的（de）斑點一致。 在（zài）這一原則下（xià），多數係統以控製斑點的重（chóng）心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟件可精確描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢複共遷移的斑點邊界。 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為（wéi）基礎的2-D分析軟件包（bāo）。 第三，一旦2-DE圖象上（shàng）的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或（huò）均值化。 由於在2-DE中出現100%的重複性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對於（yú）圖象分析係統是一個挑戰。 IPG技術的出現已使斑點配比變得容易。 因（yīn）此，較（jiào）大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在（zài）長度和平行度觀測。 用來配比的著名軟件係統包（bāo）括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚（jù）類分析、等（děng）級分類和主要因素分析已被采用，而神經網絡、子波（bō）變換和實用分析在未來可被采用。 配比通常由一個人（rén）操作，其手工設定大約50個突出的（de）斑（bān）點作為“路（lù）標”，進行交叉配比。 之（zhī）後（hòu），擴（kuò）展至整個膠。

例如：精確的（de）PI和MW（分子量）的估計通（tōng）過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象（xiàng）分析係統依據已知蛋白質的pI值產生PI網絡，使得凝膠（jiāo）上其它蛋白的PI按此分配（pèi）。 所估計（jì）的精（jīng）確度大（dà）大依賴於所建網格的結構及（jí）標本的類型。 已知的未被修飾（shì）的大蛋白應該作為標誌，變（biàn）性（xìng）的修飾的蛋白的PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數據庫中計算，利用產生的表觀分子量的網（wǎng）格來（lái）估計蛋白的分子量。 未被（bèi）修（xiū）飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯後蛋（dàn）白的出入更大。 故需（xū）聯合其他的（de）技術完成鑒定。

2  微量測序（microsequencing）

蛋白質的微量測序（xù）已成為蛋白（bái）質分析和鑒定的基石，可以（yǐ）提供足夠的信息。 盡管氨基酸組（zǔ）分分析和肽（tài）質指紋譜（PMF）可鑒（jiàn）定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進（jìn）行鑒定的主要技術。 目前已實現蛋（dàn）白質微量測序的自動化。 首先使經凝（níng）膠分離（lí）的蛋白質（zhì）直接印跡在（zài）PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然後直接置於測序（xù）儀中，可用於subpicomole水平的蛋白質的（de）鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速（sù）率產生；與質（zhì）譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個（gè）氨基（jī）酸花費3～4$。 這都（dōu）說明泛化的Edman降解蛋白質不（bú）適合分（fèn）析成百上千的蛋白質。 然而，如果在一個（gè）凝（níng）膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者（zhě）如果其他技術無法（fǎ）測定而克（kè）隆其基因是必需的，則需要進行（háng）泛化的（de）Edman降解測序。

近來，應用自動化的（de）Edman降解可產生短的（de）N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用於Edman降解，業已成為一種強有（yǒu）力的蛋白質鑒定。 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標（biāo）簽達10～20個/d，序列檢簽將適於在較小（xiǎo）的蛋白質組中進行鑒定。若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組（zǔ）分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電（diàn）點，可以更加可信地（dì）鑒定蛋白質。 選擇BLAST程序，可與數據庫相配比（bǐ）。 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進（jìn）行種間比較鑒定，又（yòu）提高了（le）其在蛋白質組研究（jiū）中的作用。

3  與（yǔ）質譜（mass spectrometry）相關的技術

質（zhì）譜已成為連接蛋白（bái）質（zhì）與基因的重要技術（shù），開啟了（le）大規模自動化的蛋（dàn）白質鑒定之門。 用來分（fèn）析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，1）樣品入機的離子源，2）測量被介入離子的分子量的裝置。 首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（MALDI-TOF）為一脈衝式的離子化技術。 它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測其分子量。 其次是電噴霧質譜（ESI-MS），是（shì）一連續離子化的方法，從液相中產生離子，聯合四極質譜或（huò）在飛行時間檢測器中測其分子量。 近年來，質譜的裝置和技術有了長足的（de）進展。

在MALDI-TOF中（zhōng），最重要的進步是（shì）離子反射器（ion reflectron）和（hé）延遲提取（delayed ion extraction），可達相當精確的（de）分子量。 在ESI-MS中，納米（mǐ）級電（diàn）霧源（nano-electrospray source）的出（chū）現使得微升（shēng）級（jí）的樣品在30～40 min內分（fèn）析成（chéng）為可能。

將反相液相色譜和串聯質譜（tandem MS）聯用，可（kě）在數十（shí）個picomole的水平檢測；若利用毛（máo）細管色譜與串聯質譜聯用，則（zé）可在低picomole到（dào）高femtomole水平檢測；當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小於femtomole的水平（píng）檢測。 甚至可在attomole水平進行。 目前（qián）多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機算法的聯合應用鑒定蛋白質。 下麵以肽質（zhì）指（zhǐ）紋術（shù）和肽片段（duàn）的測序來說明（míng）怎樣通（tōng）過質譜來鑒定蛋白質。

(1)肽質指紋術（peptide mass fingerprint， PMF）

由Henzel等人於1993年提出。 用（yòng）酶（最常用的是胰酶）對由2-DE分離的蛋白在膠上或在（zài）膜上於精氨（ān）酸或賴（lài）氨酸（suān）的C-末端處進行斷裂，斷裂（liè）所產生的精確的（de）分子量通（tōng）過質譜來測量（MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS），這一技術能夠完成的肽質量可精確（què）到0。1個分子量單位。 所有的肽質量最後與數據庫中理論肽質量相配比（理論肽是由實驗所用的酶來“斷（duàn）裂”蛋白所（suǒ）產生的）。 配比的結果是按照（zhào）數據庫中肽片段與未（wèi）知蛋白共有的肽片（piàn）段數目作（zuò）一排行榜，“冠軍（jun1）”肽（tài）片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間（jiān）的肽片段（duàn）存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較（jiào）大。

(2)肽片（piàn）段（peptide fragment）的部分（fèn）測序

肽（tài）質指紋術（shù）對其自身而言，不能揭示所衍（yǎn）生的肽片段或蛋白質。 為進一步鑒定蛋白質，出現了一係列的質譜方法用來描述肽片段。 用酶或化學方法從（cóng）N-或（huò）C-末端按（àn）順序除去氨（ān）基酸，形成梯（tī）形肽片段（ladder peptide）。 首先以一種可控製的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一係列的梯（tī）形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。 另一種方法涉及羧基（jī）肽酶的應用，從C-末（mò）端除去不同數目的氨基酸形成肽片段。 化學（xué）法和酶法可產生相對（duì）較長的序列，其分子量精（jīng）確（què）至以區別賴氨酸（128。09）和穀氨酰胺（128。06）。 或者，在（zài）質譜儀內應用源後衰變（post-source decay， PSD）和碰撞誘導解離（collision-induced dissociation， CID），目的（de）是（shì）產生（shēng）包含有僅異於一個氨基酸殘基質量的一係列肽峰的質譜。 因（yīn）此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息。 首先（xiān）進行肽質指紋鑒定。 之（zhī）後，一個有意義的肽片段在質譜（pǔ）儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應器的過程中降解為“子（zǐ）離（lí）子”。 在反應器中，用逐漸降（jiàng）低的電壓可測量至檢測器（qì）的不同大小的片段（duàn）。 但經常產生不完全的片段。 現在用肽片段來測序的方法始於70年代末的（de）CID，可（kě）以一個三聯四極質譜（pǔ）ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰（pèng）撞器（qì）內來完成。 在ESI-MS中，由電（diàn）霧源產生（shēng）的肽離子在質譜（pǔ）儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至（zhì）第二個四極（jí）質譜中，惰性（xìng）氣體轟擊使其成為碎片，所得產（chǎn）物在（zài）第三個四極質譜中測量。 與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿（yán）著酰胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續（xù）的片段間差（chà）異決定此序（xù）列在那（nà）一點（diǎn）的氨基酸的質量。 由此，序列可被推測。 由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做“肽序列標簽”。 這樣（yàng），聯合肽片段母離子的分子量（liàng）和肽片段距N- C端的距離將足以鑒（jiàn）定一個蛋白質。

4  氨基酸組分分析

1977年首次作為鑒定蛋白質（zhì）的一種工具，是一種獨特（tè）的（de）“腳印”技術。 利用蛋白（bái）質異質性（xìng）的氨基酸組分特征，成為一種獨立於序列的屬性，不同於肽質量或（huò）序列標簽。 Latter首次表明（míng）氨基酸組分的數據能用於從2-DE凝膠上鑒定蛋（dàn）白質。 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白（bái）質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上（shàng），在155℃進行酸性水解1 h，通過（guò）這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自（zì）動衍生並由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周。 依據代表兩組分間（jiān）數目差異的分（fèn）數，對數（shù）據庫中的蛋白質進行排榜，“冠軍”蛋白質具有與未（wèi）知（zhī）蛋白（bái）質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白（bái）質分數（shù）之間（jiān）的差異，僅處於冠軍的蛋白質的可信度大（dà）。 Internet上存在多個程序可用於氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位（wèi）置被用來檢索同源蛋白質。 但仍（réng）存在一些（xiē）缺點（diǎn），如由於不足的酸性水解或者部（bù）分降解會產生氨基（jī）酸的（de）變異。 故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定。

本文關鍵詞：蛋（dàn）白鑒定（dìng）方（fāng）法