範（fàn）圍

本標準規定了水（shuǐ）產品中磺（huáng）胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲（jiǎ）基（jī）嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。

本標準適用於水產品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基（jī）嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量（liàng）的測定，其它磺（huáng）胺類藥物（wù）的測定可（kě）以參照本標準。

規範性引用文件

下（xià）列文件（jiàn）中的（de）條款通過本標準的引用而成為（wéi）本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單(不包括（kuò）勘誤的內容)或修訂版均不適（shì）用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使（shǐ）用這些文件的最新版本。凡是（shì）不注（zhù）日期的（de）引用文件（jiàn），其最新版本適用於本標準。

GB/T6682分析實驗室用水（shuǐ）規格和試驗方法

原理

用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取（qǔ），正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相（xiàng）色譜柱分離，熒（yíng）光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內（nèi）標（biāo）物，內標法定量（liàng）。

試劑

本標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處應無幹擾峰，實（shí）驗用水應符合（hé）GB/T6682中一級（jí）水標準（zhǔn）。

標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二（èr）甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺（àn）5-甲氧嘧（mì）啶，純度均大於98.0%。

丙酮：色譜純。

正己烷：色譜純（chún）。

乙酸乙（yǐ）酯：色譜純（chún）。

乙腈（jīng）：色譜純。

甲醇：色譜純。

熒光胺：純度大於99.0%。

乙（yǐ）酸鈉：分析純。

冰乙酸：優級純。

鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水並稀釋至1000mL。

乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶於蒸餾水中，定容（róng）至100mL。

熒光胺溶（róng）液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加（jiā）15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處。現（xiàn）配現用（yòng）。

標準儲備液：100mg/L，稱取標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇（chún）溶解並定容至100mL。避光冷藏保存，保存（cún）期為（wéi）一個月。

混合標準中間液：1mg/L，移取標準（zhǔn）儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋並（bìng）定容至100mL，在（zài）室溫（wēn）下混勻。

內標儲備液（yè）：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解並定容至（zhì）100mL。避光（guāng）冷藏保存，保存期為一個月。

內標中間液（yè）：1mg/L，移取內標儲備液1.00mL，用甲醇稀釋並定容至100mL，在室溫下混勻。

混合標準（zhǔn）使用液：取混合標準中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內標中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀（xī）釋至2mL，配成濃度分（fèn）別（bié）為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標準使用液，其中內標濃度為0.05mg/L。

儀器與（yǔ）設備

液相色譜儀：配熒光檢測器。

電子天平：感量0.0001g。

電子天平：感量0.01g。

高速組織搗碎機。

均質機。

離心機。

旋渦（wō）混勻器。

氮吹儀。

往複式（shì）振蕩器。

聚丙烯離心管：15mL、50mL。

容量（liàng）瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。

玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

巴斯（sī）德吸管。

色（sè）譜條件

色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

柱溫：45℃。

流動相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加（jiā）入冰乙酸調節pH至（zhì）3.0配（pèi）製成乙酸溶液。

流速：1mL/min

進樣量：20μL。

激發波長：405nm。

發射（shè）波長：495nm。

步驟分析

樣品製備

從原始樣品中（zhōng）取出部分有代表性的樣品，高（gāo）速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少於500g樣品，混勻，均（jun1）分成兩份。裝入清潔容器，加（jiā）封，標明標記。-18℃以下冷凍保（bǎo）存。

提取

將樣品解凍，稱取2.00g，置於50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標準中間液(4.16)100μL，用玻（bō）璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質機14000rpm均質1min，往複式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將（jiāng）乙酸乙酯層小心轉移到15mL具塞刻（kè）度試（shì）管中，40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心管（guǎn）中加入乙酸乙酯10mL，旋渦（wō）混勻30s，振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸（suān）乙酯層小心轉移到原（yuán）15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至5mL。然後在試管中加入（rù）2.00mL2mol/L的鹽酸（suān）溶液，旋渦混勻1min，加蓋後振動10min，3000rpm離心8min，用巴（bā）斯德吸管移去乙酸乙酯層，在餘液中加入正己烷5mL，旋（xuán）渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

衍生

向樣品瓶中（zhōng）加入200μL混合標準使（shǐ）用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min後供液相色譜分析。

色譜分析

取（qǔ）衍生後的樣品提取液20μL進樣，記（jì）錄峰麵積，響應值均應在儀器檢（jiǎn）測的線性範圍之內。根據標（biāo）準樣品的保留時間定性，內標法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參（cān）見附錄A。

工作曲線

稱取空白樣（yàng）品2.00g，分別添加混合標準（zhǔn）中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺（huáng）胺（àn）殘留量分別為（wéi）0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰麵積與內標物（wù）峰麵積的比值為縱坐（zuò）標，磺（huáng）胺含量為（wéi）橫坐標，繪製工作曲線。

計（jì）算

用（yòng）色譜數據處理（lǐ）軟件或按下式計算樣品（pǐn）中磺胺（àn）殘留量：

式（shì）中：

X——樣品（pǐn）中磺胺殘留量（liàng），單位為毫克每千克(mg/kg)；

s——樣品溶液中磺胺峰麵積，單位為counts；

s1——樣品溶液中內（nèi）標峰（fēng）麵積，單位為counts；

S——標準（zhǔn）溶液中磺胺峰麵積，單位為counts；

S1——標準溶液中內標峰麵積，單（dān）位為counts；

x——加標樣品中磺胺殘留量，單位為毫克（kè）每千克(mg/kg)。

方法回收率

濃（nóng）度範圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見回收率表。

回收率表

名稱

回收率

磺胺嘧啶

88.0%～111.8%

磺胺（àn）甲基嘧啶

90.0%～110.8%

磺胺二甲基嘧啶

91.0%～110.1%

磺胺甲基異噁唑

107.0%～116.7%

方法檢（jiǎn）出限

本方（fāng）法檢出限為0.010mg/kg。

精密度

在重複性條件（jiàn）下（xià）獲得的兩（liǎng）次獨（dú）立測（cè）定（dìng）結果（guǒ）的絕（jué）對差值不（bú）得超過算術平均值的15%。

本文關鍵詞：液相色（sè）譜法 水產 磺胺含量