RNA酶保護法是近十年（nián）發展起來的（de）一種全新的mRNA定量分析（xī）方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性（xìng）結合，形成雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化（huà）形成寡核糖核酸，而待測目（mù）的基因（yīn）與特異RNA探針結合後形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保（bǎo）護實（shí）驗。

目錄

· 一、 RNA酶保護（hù）試驗的介紹

· 二、試劑準備（bèi）

· 三、操作步驟

· 四、電泳與（yǔ）放射自顯影

· 五、注意事項

· 六、技術文檔（dàng）

RNA酶保護試驗是（shì）通過液相雜交（jiāo）的（de）方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。

一、 RNA酶保護試驗的介紹

RNA酶保護試驗（RNase Protection Assay，RPA） 是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品（pǐn）雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下（xià）幾個優點：

1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由於Northern雜交（jiāo）步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降（jiàng），而（ér）RPA將所有雜交體係進行電（diàn）泳，故損（sǔn）失小（xiǎo），提高了靈敏度。

2. 由於PCR擴增過（guò）程中效率不均一和反應“平台”問題，基於PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性（xìng）較高。

3.由於與反義RNA探針雜交（jiāo）的樣品RNA僅為該（gāi）RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品（pǐn）仍（réng）可進行分析。

4.步驟（zhòu）較少（shǎo），耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉（zhuǎn）膜（mó）和洗膜的過程。

5. RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身（shēn）複性問題（tí），無須封閉。

6. 一個雜交（jiāo）體係（xì）中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題（tí）。

7. 檢測分子長度可以任意（yì）設置，靈活性大。

RPA的缺點是（shì）需要同位素標記探針。

二、試劑準備

1. GACU POOL：取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 雜（zá）交緩衝（chōng）液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.RNase A（10mg/ml） 8μl.RNase T1（250U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2ml

三、操作步驟

（一） 反義RNA製備

可由含（hán）T7或SP6啟動子的重組質粒為模板製備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板製備，本文介紹（shào）後者（zhě）。

1.設計含T7啟動子的PCR引物

由於PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下遊引物5’-端要含T7啟動子序列: T7啟（qǐ）動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引（yǐn）物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的（de）長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長（zhǎng）的片段，再以該片段為模（mó）板擴（kuò）增出（chū）較短的片段，以（yǐ）保證探針的特異性，如下圖所示

2.PCR 先用上（shàng）遊（yóu）引物和下遊引物（wù）Ⅰ進（jìn）行PCR，再以PCR 產物為（wéi）模板，用上遊引物和（hé）下遊引物Ⅱ-T7進行（háng）二次PCR。

3.探針合成標記與純化（huà）

在0.5ml 離心管中加入下列（liè）試劑：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP.CTP.ATP各2.75 mM，UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μl

DTT （二硫蘇（sū）糖醇，0.1M） 1μl

5×轉錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶（méi） （15U） 1μl

混合後，短暫離心，37℃保（bǎo）溫（wēn）1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl） 1μl， 37℃ 15min， 然後（hòu）75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶（méi）。

加（jiā）入：飽和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母（mǔ）tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下（xià）充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中，加入100μl氯（lǜ）仿，混勻，離心（xīn）10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加（jiā）入3M NaAc 10μl，預冷無水乙醇250μl，混勻後，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄（qì）上清液，沉澱用（yòng）75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min， 棄上清液。室溫（wēn）下（xià）揮發殘留（liú）乙醇。加（jiā）入50μl雜交緩衝液溶解沉澱（diàn），4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電（diàn）泳檢測探針質量。

（二） 雜交（jiāo）

1.RNA提取後溶解在雜交緩衝液（yè）中，濃度為1μg/μl。

2.取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整） 於0.5ml 離心管中。

3.80℃保溫2min，然後40-45℃下雜交12-18hr。

（三（sān）） 消化

1.雜交管於（yú）37 ℃保溫15min，加入RNase消化液，37 ℃保溫30min。

2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻（yún），37 ℃保溫10min。

3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

4.轉移上層（céng）液到另一0.5離心管中，加入（rù）10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入（rù）200μl異丙醇，混勻後，置-20℃ 30min，4 ℃離心，135000g×10min。

5.棄上清（qīng）液，室（shì）溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩衝液溶解沉（chén）澱。

四、電泳與放射自顯（xiǎn）影

（一） 配製凝膠：（50ml）

40%丙烯酰胺-亞甲（jiǎ）雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml

溶解後加入25%過硫（liú）酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入（rù）電泳槽中，插入梳，待膠凝（níng）固。

（二） 預電泳（50ml）

以1×TBE為上（shàng）下槽電泳緩衝液，加上電壓後（hòu）進行預電泳，如果用測序電泳（yǒng）裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 ℃。待膠板溫度（dù）達（dá）50 ℃時，暫停電泳，準備加樣（yàng）。

（三） 加樣

將已溶解在加樣緩衝液中的（de）樣品80 ℃加熱（rè）2min，立即加（jiā）樣到（dào）膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳） 。

（四（sì）） 電泳結束

電（diàn）泳結束後，打開膠板，用（yòng）濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜（mó），放置於（yú）暗盒中，暗室紅（hóng）光（guāng）下（xià），壓上（shàng）一張X片，蓋上暗盒（hé），-70℃曝光1-3天。暴光結束後，將X光片顯影.定影.水洗.晾幹。

五、注意事（shì）項

1.本實驗大部分（fèn）為RNA操作，注意RNA酶（méi）的汙染。

2.RNase消化液消化未雜交的單鏈（liàn）RNA和探針（zhēn）RNA，當探針與樣品之間有堿基（jī）錯配時（shí），錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行（háng）PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3.同位素對RNA合成有一定影響，有時會產（chǎn）生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長（zhǎng）。

4.RNase消化液有時會產生過度消（xiāo）化而無（wú）檢測信號，可以將（jiāng）消化液稀釋10-100倍後使用。

本文關鍵詞：RNA酶保護試驗方法