範圍

本標準規定了水產品中磺胺（àn）嘧啶、磺胺甲基（jī）嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺（huáng）胺甲基異（yì）噁唑（zuò）殘留量（liàng）的液相色譜測定方法。

本標準適用於（yú）水產品（pǐn）中（zhōng）磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二（èr）甲基嘧（mì）啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的測定，其它磺胺類（lèi）藥（yào）物的測定（dìng）可以參照本標準。

規範性（xìng）引用文件

下列文件中的（de）條款通（tōng）過本標準的引（yǐn）用而成（chéng）為本（běn）標準的條款。凡是（shì）注日期的（de）引用文件（jiàn），其（qí）隨後所有（yǒu）的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用於本標（biāo）準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最（zuì）新版本。凡是不（bú）注日期（qī）的引用文件，其最新版（bǎn）本適用於本標準。

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

原理

用乙（yǐ）酸乙酯（zhǐ）提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光（guāng）胺衍生，反相色譜柱分離（lí），熒光檢（jiǎn）測（cè）器檢測，磺胺5-甲氧（yǎng）嘧啶為內標物，內標法定量。

試劑

本標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處（chù）應無（wú）幹擾峰（fēng），實驗用水應符合GB/T6682中一級水標準。

標準品：磺胺嘧啶、磺（huáng）胺甲基嘧啶、磺胺二甲（jiǎ）基嘧啶、磺胺甲（jiǎ）基異噁唑（zuò），磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大於98.0%。

丙酮：色譜純。

正己烷：色譜純。

乙酸乙酯：色（sè）譜純。

乙腈：色譜（pǔ）純。

甲醇：色譜純。

熒光胺：純度大於99.0%。

乙酸（suān）鈉：分析純。

冰乙酸：優級純。

鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水並稀釋至1000mL。

乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取（qǔ）28.7g無水乙酸鈉溶於蒸餾水中，定容至100mL。

熒光（guāng）胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶（róng）解（jiě），存放在暗處。現配現用。

標準儲備（bèi）液：100mg/L，稱取（qǔ）標準品10mg(稱準（zhǔn）至0.1mg)，用甲醇溶解並定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月（yuè）。

混合標準中間液：1mg/L，移取標準儲備液（yè）各1.00mL，用甲醇稀釋並定容至100mL，在室溫下混勻。

內標儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至（zhì）0.1mg)，用甲醇溶解並定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

內標（biāo）中間液：1mg/L，移取內標儲備液1.00mL，用甲醇稀釋（shì）並定（dìng）容至100mL，在室溫下混勻。

混（hún）合標準使用液：取混合標準中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內標中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的（de）混合標準使用液，其中內標濃度為0.05mg/L。

儀器與設備

液相色譜儀：配熒光檢測器。

電子天平：感量0.0001g。

電子天平：感量0.01g。

高速組織搗碎機（jī）。

均質（zhì）機（jī）。

離心機。

旋渦混勻器。

氮吹儀（yí）。

往複（fù）式振（zhèn）蕩器。

聚丙烯（xī）離心管（guǎn）：15mL、50mL。

容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。

玻（bō）璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

巴斯（sī）德吸管。

色譜條件

色（sè）譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

柱（zhù）溫：45℃。

流動相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中（zhōng）加入（rù）冰乙酸調節pH至3.0配製成乙酸（suān）溶液。

流速：1mL/min

進樣量（liàng）：20μL。

激發波長：405nm。

發射波長（zhǎng）：495nm。

步（bù）驟分析

樣品製備

從原始樣品中取出部分（fèn）有代表性的（de）樣品，高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少於500g樣品，混勻（yún），均分成兩份。裝入（rù）清潔容器，加封，標明標記。-18℃以下（xià）冷（lěng）凍保存（cún）。

提取

將樣品解凍，稱取2.00g，置於50mL聚丙烯離（lí）心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標準中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪（jiǎo）勻，再加（jiā）乙酸乙酯10mL，均質機14000rpm均質1min，往複式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯（zhǐ）層小心轉移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心（xīn）管中（zhōng）加入乙酸乙酯10mL，旋渦混（hún）勻30s，振動10min，3000rpm離（lí）心10min，將乙酸乙酯層小心轉移到原15mL具塞刻度試管（guǎn）中，40℃以下氮氣吹至5mL。然後在（zài）試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加（jiā）蓋後振動10min，3000rpm離心（xīn）8min，用巴斯德（dé）吸管移去乙酸乙酯層，在餘液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去（qù）正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

衍（yǎn）生

向樣品瓶中加入200μL混合標準使用液或樣品提取液、200μL乙（yǐ）酸鈉（nà）溶（róng）液和80μL熒光胺溶液，旋（xuán）渦混勻30s，20min後供液相色譜（pǔ）分析。

色譜分析

取衍生後的樣品提取液20μL進樣，記錄峰麵積，響應值均應在儀器檢測的線（xiàn）性範圍之內。根據（jù）標準樣品的保留時間定性，內標法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參見附錄A。

工作曲線

稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標準中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留（liú）量分別為（wéi）0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰麵（miàn）積與內標物峰麵（miàn）積的比值為縱坐標，磺胺含量為橫坐標，繪製（zhì）工作曲線。

計算

用色譜（pǔ）數據處理軟件或按下式計算樣品中磺胺（àn）殘留量：

式中：

X——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)；

s——樣品溶液中磺胺峰麵積，單位為counts；

s1——樣品溶液中內標峰麵積，單位為counts；

S——標準溶液中磺胺峰麵積，單位為counts；

S1——標準溶液中內標峰麵積（jī），單位為counts；

x——加（jiā）標（biāo）樣品中磺胺殘留量（liàng），單（dān）位為毫克每千克(mg/kg)。

方法回收率

濃度範圍為（wéi）0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見回收率表。

回（huí）收率表

名稱

回收率

磺胺嘧啶

88.0%～111.8%

磺胺甲基嘧啶

90.0%～110.8%

磺胺二甲基嘧啶

91.0%～110.1%

磺胺甲基異噁（wù）唑

107.0%～116.7%

方法檢出限

本方法檢出限為0.010mg/kg。

精密度

在重（chóng）複性條件下獲得的兩（liǎng）次獨立測定結果的（de）絕對差值不得超過算術平均值的15%。

本文關鍵詞：應用液相色譜法測定水產中的（de）磺胺含量