1.  為什麽免疫後沒有效價或免疫後效價低？

答：可以從這幾個方麵一一考慮：

（1）設計的抗原與被免疫的動物（wù）內源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分（fèn）子物質。對於前一種情況應該重新設計抗原，設計抗原時盡量選取（qǔ）目標蛋白特異性的序列，可以設（shè）計為短肽然後再與載體蛋白偶聯之（zhī）後免疫；對於後一種情況（kuàng），首先確認小分子物質是（shì）否（fǒu）已經正確地和載體蛋白偶（ǒu）聯，如果偶聯沒有問題，可以更換其它的載體（tǐ）蛋白，一般（bān）來說KLH是所有載體中較為優先考慮的蛋白（bái）。

（2）免疫的周期不（bú）正確。免（miǎn）疫周期過長或過短，各免疫（yì）步驟之間的間隔（gé）過長（zhǎng）或過短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關動物免疫的部份，實際操作中的相關程（chéng）序與本站（zhàn）推薦的程序（xù）相差盡裏不超過50%的（de）偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑（jì）在免疫時，對於某些抗原可能效（xiào）果不佳，弗低佐劑（jì）也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嚐試。

（4）免疫劑量不（bú）合（hé）理。過大的免疫劑量可（kě）能導致免（miǎn）疫耐受，過少的免疫劑量可能（néng）無法激活免疫應答。一般來說，實際免疫劑（jì）量與本站所推薦的劑量不要相差兩（liǎng）倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對於有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

（6）測效價的過（guò）程存在錯誤操作（zuò），尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正（zhèng）確。同時，一（yī）抗（即血（xuè）清）稀釋梯度盡量放寬（kuān），一般建（jiàn）議（yì）從1：500或1：1000開始（shǐ）作梯度稀釋。對（duì）於小分子（zǐ）物質，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什麽融合後細（xì）胞不長或者融合後克隆（lóng）很少？

答：可以從這幾（jǐ）個方麵考慮：

（1）免疫用的動物品係不正確或者品係（xì）不純。免疫用的（de）動（dòng）物（wù）一般應該與骨（gǔ）髓瘤來源的（de）動（dòng）物是相同品係，例如使用SP2/0骨髓瘤（liú）細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品係純正（zhèng）的小（xiǎo）鼠。

（2）培養（yǎng）基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度（dù）過高或HT的濃度過低，建議（yì）用純的骨髓（suǐ）瘤和已有的雜交（jiāo）瘤作（zuò）HAT濃度篩選。

（3）培養（yǎng）基不正確或血清濃（nóng）度不正確（què）或使用了劣質血清。

（4）未正確製備飼養層細胞。參見本站有關（guān）飼養（yǎng）層細胞製備的部份。

（5）接種雜交瘤細（xì）胞的培養板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合後，未及時轉移或（huò）稀釋細胞（bāo）。有人在做融合後喜歡把融合的細胞（bāo）先放在培養瓶中培養，然後再滴到96孔板上。如果在培養瓶中（zhōng）培養的時間過長，也可能出現克隆利率少的情況（kuàng）。

（7）細胞被汙染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物汙染。即使看不到有明（míng）顯的微生物，也（yě）應該考慮是否有支原體汙染，有條件的可以做支原（yuán）體檢測。

（8）細胞培養條件不正確，確（què）保細胞培養在恒定的37度較濕的環境，同時（shí）保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關的不恰當的因素。詳（xiáng）見本站有關細胞融合的部份。

3.  為什麽融合後得不到（dào）陽性克隆？

答：可能的原因：

（1）動物未免（miǎn）疫（yì）成功就進行了融合。具（jù）體解決方法參照本頁麵第1個問（wèn）題。

（2）融合後得到的克隆較少，故得到陽性克（kè）隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁麵第2個（gè）問題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物（wù）質不可以直接包被（bèi）到酶標板上，再如使用了不（bú）適當的二抗等諸多（duō）因素，也有人（rén）直接不使（shǐ）用ELISA作為篩選方法的，成功率也有（yǒu）待商榷。

（4）抗原成（chéng）份（fèn）與（yǔ）細胞培養條件中的物質相同或（huò）類似，或（huò）者與篩選過（guò）程中（zhōng）有同抗原結構相同或類似的物質產生（shēng）了競（jìng）爭反應。舉個簡單的（de）例子，如果需要製備（bèi）抗BSA 的單抗，則養雜交瘤（liú）的培養（yǎng）基（jī）中不可以使用牛（niú）血（xuè）清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結（jié）合，最後做ELISA篩選（xuǎn）的時候無（wú）法得到陽（yáng）性（xìng）結果。解決的辦法隻有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養基。再如，如果（guǒ）需要（yào）製備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液（yè）不可以（yǐ）使用脫脂奶粉。

（5）其它（tā）所有能影響ELISA等相關篩選手段的因素。這一（yī）部份（fèn）詳見本站有關ELISA實驗的講解（jiě）與討論。

4.  為什麽我（wǒ）的（de）細胞（bāo）生長很慢？

答：可能的原因（yīn）：

（1）使用了劣（liè）質的（de）培養耗材、培養基、血清、HAT或HT。建議新（xīn）手使用知名廠商的試劑或（huò）耗材。對於血清（qīng），可能需（xū）要從多個廠（chǎng）家（jiā）選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗（yàn）。在試用血清（qīng）的時（shí）候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養實驗（yàn），根據骨髓瘤細胞的倍增速度（dù）確實血清質量。

（2）使（shǐ）用的血（xuè）清或培養基濃度不正確。仔細檢查配方（fāng）是否正（zhèng）確。

（3）製備飼養層的方法不正確。參見本頁麵第二個問題。

（4）其它問題，可以參考本頁麵第二個問題。

5.  我（wǒ）的克隆原來是陽性（xìng）的，為什麽後來轉為陰性了（le）？

答：首先要注意的（de）是，正常情況下，雜交瘤也（yě）不是絕對穩定的，確實容易發生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環（huán）境中生長（zhǎng），如（rú）從（cóng）小孔擴大到大孔，或者複蘇操作時，更容易發生陽（yáng）性變為陰性。但是也有一（yī）些辦（bàn）法盡量減少陽（yáng）性變為（wéi）陰性的辦法。一般（bān）可以從這幾（jǐ）個方麵加以注意：

（1）永遠保證細胞處在（zài）最佳的生（shēng）長（zhǎng）環境中。尤其是培養基不能長期不換，一般來（lái）說，當細胞增（zēng）長（zhǎng）到一定密度的時候，培養（yǎng）基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養基了，除了換培養基，同時應該控製好細胞的密度，可以吹走（zǒu）過多的（de）細（xì）胞，使新加入的培養基不至於（yú）很快被消耗。

（2）對於重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保（bǎo）種。

（3）不要過（guò）於頻繁（fán）操作細胞，當細胞生長密度不（bú）是（shì）很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容（róng）易出現死亡或者生長形態（tài）發生明顯變化。

（4）對於傳代次數較多的細胞株需要經常進行亞克隆，並將每一次（cì）的亞克隆株也作凍存。

（5）當細胞（bāo）被支原體等（děng）微生物汙染，也會（huì）發生由陽性轉（zhuǎn）為（wéi）陰性（xìng）的情況。

6.  為（wéi）什麽我做（zuò）亞克（kè）隆後長不出（chū）克隆來？

答（dá）：亞克隆失敗的（de）原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還（hái）有一些獨特（tè）的原因。

（1）亞克隆時，原始孔裏的細胞狀態不好，經過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很（hěn）差，以至於長不出克隆。

（2)亞克隆時，沒有（yǒu）按照（zhào）正確的（de）數量取出（chū）細胞，在本站有關亞（yà）克隆操作的頁麵上提到（dào）過，亞克隆的過程服從泊鬆分布，如果取出的細胞遠（yuǎn）遠（yuǎn）低（dī）於平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠（yuǎn）低於平均每孔一個細胞（bāo），則也（yě）可能出現（xiàn）長（zhǎng）不出克隆的結果（guǒ）。

（3）未（wèi）添（tiān）加飼養層細胞。單個細胞在完全培養（yǎng）基中極難培養，如果不添加（jiā）飼養（yǎng）層細胞，則（zé）它們很可能很快就死亡，最終（zhōng）就長不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或（huò）A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交（jiāo）瘤的生長並不（bú）是必須的，但是HT確（què）實可以加快細胞生（shēng）長，改善細胞生長狀態（tài）。

（5）使（shǐ）用無血清培養基。這一點是很冷僻的（de）一個（gè）因素。雖然很少有人使用無血清培養基製備單抗，但是在某些血清可能幹預篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養基來培養雜交瘤，但是需要（yào）注意的是，在很多種無血清培養基中，單個細胞是（shì）很難長成克隆的。最好的（de）解決辦（bàn）法就是先用（yòng）含有血清的（de）培養基培養它們，等克隆長出（chū）後再把培養（yǎng）基徹底更換（huàn）為無血清培養基。

7.  為什麽我凍存（cún）的細胞很難複（fù）蘇或者複蘇不活？

答（dá）：這個問題要從兩個方麵來回答，一是凍存方麵，二是複蘇問題。 對於凍存過（guò）程，需要注意（yì）：

（1）凍存液的配方。這個問題很關鍵，一個良（liáng）好的（de）凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好（hǎo）的凍存液配方可能會讓細胞（bāo）傾刻死亡。目前認為比較好的配方（fāng）有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養過雜交瘤的培養基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃（nóng）度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會死於冰晶形成（chéng）時的張力，如（rú）果濃度（dù）過高，則細胞中毒而亡。如果（guǒ）使用第二（èr）個配方，注（zhù）意（yì）一定要（yào）用養過雜交（jiāo）瘤（liú）的培（péi）養基，而盡量（liàng）不要用一般的完全（quán）培養基，而且（qiě）一定是配養需要凍存的那一株的培養基（jī）。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發表評論。如果新手確實對（duì）這個沒把握，市場上也有商品化（huà）的凍存液，買回來按照說明書操（cāo）作就OK了。

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的（de）時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞（bāo）膜變得（dé）非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，複蘇成活的機（jī）會（huì）就明顯會下降。

（3）凍存的程序也非常重（chóng）要。實踐表明，以每分鍾1 ℃的速度下降凍存細胞是最理想的。如果條件（jiàn）簡（jiǎn）易，可（kě）以把細胞放在4 ℃半小時左右，然後再在-20 ℃放置1-2小時，最後轉入-80 ℃放（fàng）置過夜，最終轉入液氮保存。需要（yào）短期（qī）保存的，直接放-80 ℃也行。現在市場上有（yǒu）比（bǐ）較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然後直接放-80 ℃就行，等時（shí）間夠長（zhǎng）後直接轉至液氮中即可。

（4）細胞需要保存（cún）在液氮的氣相中，而不（bú）是（shì）泡在液相裏（lǐ）。否（fǒu）則（zé）液氮很容易進入凍存管。這一（yī）點很（hěn）多人都沒有注意，大部份人都是直接往（wǎng）液相裏放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的（de）液氮中可能含（hán）有微生物（wù）或者孢子什麽的，如果（guǒ）放在液相中，這些微生物或孢子（zǐ）就有機會進（jìn）入凍（dòng）存管，最終可能造成細胞汙（wū）染。

（5）保證（zhèng）被凍存的細胞處（chù）於良好的生長狀態，並且（qiě）沒（méi）有被汙（wū）染。

對於複（fù）蘇過（guò）程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細胞內產生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積（jī）的37 ℃熱水複蘇，並不斷晃動（dòng）凍存管。

（2）複蘇過程（chéng）不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子（zǐ）弄濕，否（fǒu）則熱水有可能汙染管口，造成複蘇（sū）的細胞（bāo）被汙染。

（3）有的人（rén）複（fù）蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液裏的DMSO帶到了新的培養體係裏，容易對細胞（bāo）造成毒害，因此強烈（liè）建議將（jiāng）融化的細胞離心（xīn）後去（qù）掉凍存液，然（rán）後用新的完全培養基重懸，再接種到新的容器內培養。

8.  為（wéi）什麽我的（de）細胞總是汙染？如何可以救活汙染的細胞？

答：養細胞出現汙染（rǎn），幾乎是每個細胞培養技術員容易出（chū）現的問題。要防止細胞汙染，無非就是保證培養環境無汙染，保證所用的所有試劑都無汙染源（yuán），同時提高操作時的警惕性（xìng），這些基本的知（zhī）識這裏（lǐ）就不再廢話了。下（xià）麵講一講（jiǎng）如何挽救一株已經被汙染的細胞株。

（1）體外用抗生素消滅。一般來（lái）說，一旦發現細胞被微生物汙染，應該馬上進行處理（lǐ），也許還有一線挽救（jiù）的機會。 但是這種挽救不是盲目的，首先（xiān）應該決斷是哪一類生物造成的汙染。細胞的汙染大致可以（yǐ）分三類：細菌汙染、真菌汙染（rǎn）和支原體汙（wū）染。 在顯微（wēi）鏡下仔細（xì）觀察，這三種微生物汙染區別還是比較明顯的：如果（guǒ）有大量運動的微生（shēng）物，且形態較大，輪廓（kuò）清晰可見，呈較大幅（fú）度運動，並且培養基在短時間（jiān）內（nèi）變酸，則很可能是細菌汙染；如果在顯微鏡下觀察（chá）有典型的斑狀（zhuàng）或絲狀微生物（注（zhù）意（yì）與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區別開），基本上看不到明（míng）顯（xiǎn）的運動，則很可能是真菌汙染；如果（guǒ）看不（bú）到明顯的微（wēi）生物，並且培養基沒有明顯的顏色（sè）上的變化，而細胞狀態很差，細胞邊緣極其不光滑，而且細胞又莫名其妙地死亡或生長極其緩慢，則有可能為支（zhī）原體汙染，但不能下明確（què）的結論，如果非常需要知道是（shì）否為（wéi）支原體汙染可以使用相（xiàng）關的試劑盒（hé）進行檢測。 對於細菌或真菌的汙染，可以先把細胞收集起來，用幹淨的（de）培養基（jī）洗滌離心，交替進行幾次（cì），再把洗幹淨的細胞（bāo）放在新的培養板或培養瓶等容器（qì）內，加高濃度的抗生素培養，同時強烈（liè）建議加（jiā）入（rù）小鼠腹腔巨噬（shì）細（xì）胞作為飼養層，以輔助消除微生物。對於細菌汙（wū）染，可以把青黴素（sù）的濃度提高至（zhì）10倍（bèi）左右（yòu），鏈黴素濃度提高至5-10 倍，也可以用10倍濃度的卡（kǎ）那黴素替代鏈（liàn）黴素。 對（duì）於真菌汙染，可以在（zài）培養基中加入（rù）約5 ug/ml的咪康唑（注射用達克寧）抑製。 對於這兩種情況的汙染，采用上述方法處（chù）理後，待（dài）細胞稍有好轉，並且沒有發現更大規模的汙染時，需要盡快重複上麵（miàn）的（de）處理步驟。需要注意的是，此時細胞生長（zhǎng）受抗生素（sù）的影響比較大故而生長很慢。如果（guǒ）多次傳代均未發現汙染複發，可以慢慢降低抗生（shēng）素濃度直（zhí）至常規濃度，確定是否完全根除（chú）汙染。最好進行一次有限稀釋的亞克隆操作，以獲得更加純淨的細胞株。 而（ér）對於支（zhī）原體汙染，則比較麻煩，一般的抗生素是很難解決的，對於輕度的汙染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素（sù）和10 ug/ml左右的環丙沙星交替處理。如果得到明顯的（de）緩解，建議馬上（shàng）做亞克隆操作，看看是否得到汙染（rǎn）根除的（de）細胞株（zhū），如果此方法無效（xiào），則不能（néng）單純利（lì）用抗生素來解決（jué）汙染問題。

（2）體內法。這個辦法很簡單，原理就是（shì）動物體有強大（dà）的免疫係統，一般的微生物都可以被動物體消滅（miè）。具體操作和製（zhì）備腹水的方法完（wán）全一樣，即先（xiān）用IFA或石蠟製敏小鼠（shǔ），數天後腹腔注射汙染的雜交瘤。如果情況緊急，致（zhì）敏當天注射雜交瘤也（yě）行。一（yī）般十天後小鼠產生腹水，在超淨台無（wú）菌采出腹水，其中即含有大量（liàng）的雜交瘤（liú）細（xì）胞，一般是（shì）可以除掉汙染的微生物的。也（yě）可以在小（xiǎo）鼠背部注射雜交瘤，十（shí）幾（jǐ）天後可以看到實體瘤形成，也可以在（zài）超淨台上（shàng）無菌采摘，然後放回培養板或培養瓶等容器內培養。如果被汙染的細胞很少，比如說（shuō）在（zài）96孔板上就被汙染了，這時候不（bú）能進行腹腔注射，也不要進行皮下注射，否則細胞很容易（yì）被老鼠的免疫（yì）係統攻擊而死亡的，最好的辦法是采用脾內注射的方法進行，同時在（zài）腹腔（qiāng）內用IFA或石蠟油致敏，十幾天後，同樣可以形成腹水，其中即含有幹淨的雜（zá）交瘤細胞。 如果擔心小鼠會受到微生物感染，可以在（zài）培養（yǎng）基中先加入高濃度的抗生素，然後連同抗生素一起（qǐ）注射到小鼠體內。

如果確定細胞汙染極其嚴重，並且細胞（bāo）已（yǐ）大麵積死亡，建（jiàn）議（yì）放（fàng）棄（qì），迅速做好環境清潔工（gōng）作，對細胞操作間作徹底消毒，重新（xīn）做融合而獲（huò）得新的細（xì）胞株，不可因小失大造成其它的細胞也被汙染。

9.  為什麽我的雜交瘤細胞不能（néng）製備腹水或（huò）者製備的腹水（shuǐ）中（zhōng）沒的抗體或（huò）腹水沒有效價？

答： 不能製備腹水的原因大部份是人為的原因：

（1）致敏不正確（què），例如使用了不正確的（de）致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間（jiān）相（xiàng）差太久。

（2）雜交瘤的接種位（wèi）置不正確，沒有打到腹腔，而（ér）是打到了皮下。

（3）接種的雜交瘤細胞數量太少或者細胞狀態不（bú）好。一般不應少於10萬個細胞，建（jiàn）議在100萬個細胞左右為宜。

（4）製備腹（fù）水小鼠的（de）種係與參與融合的細胞（bāo）來（lái）源的動物種係相（xiàng）差太（tài）遠，以至製備腹水的小鼠對（duì）雜交瘤有強大的免疫反應將其殺死，建議更換小鼠品係重新（xīn）接種。

對於腹水沒有效價，可（kě）能的原（yuán）因：

（1）製備腹水的雜交瘤極不穩定，打（dǎ）到小鼠身上之（zhī）前就失去抗體分泌（mì）能力或者（zhě）打到腹腔內就失去了分（fèn）泌能力（lì）。

（2）致敏小鼠時采用了錯誤的致（zhì）敏劑，如使用了弗氏完全（quán）佐劑，這時即使不打雜交瘤（liú），小鼠也會產生腹水。

（3)極其罕見的情況，就是此雜交（jiāo）瘤生產的抗體可以與小鼠體內的分子相互作用，於是雜交瘤產生的抗體被小鼠的相關蛋白中和，這種情況下，小鼠的身體可能（néng）會出現明顯的異常。

（4）檢測腹水效價的實驗方案有問題，或者（zhě）腹水稀釋比過大。

10.  免疫失敗的可能原因及應采取的措施

答：有時不能獲（huò）得滿意的抗血（xuè）清，可從下列（liè）幾方麵找（zhǎo）原因，並（bìng）改進之。

（1）免疫動物的種屬及（jí）品係是（shì）否合適，可考（kǎo）慮改變動物的種屬或品係，或擴大免疫動物的（de）數量。

（2） 抗原質量是否良好，可（kě）改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批（pī）號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提（tí）取方法。

（3） 製（zhì）備的免疫原是否符合要求（qiú），可從偶聯劑，載體、抗原或載體的比例、反（fǎn）應時間等多方麵去考慮，並加以改進。

（4） 所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

（5） 免疫的方法、劑量，加強免疫的間（jiān）隔時間和次數，免疫（yì）的途徑是（shì）否合適。

（6） 動物的（de）飼養是否得當，如營養（飼料、飲水）、環境衛生（通風（fēng）、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

11.  製備單克隆（lóng）抗體影響因素、失敗原因分析

答：由於製備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

（1）汙染： 包括細菌、黴菌和支原體的汙染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一（yī）旦發現有黴菌汙染就應及早將汙（wū）染板棄（qì）之，以免汙染整個培養環境。支原體的（de）汙染主要來源於牛血清，此外，其（qí）它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體汙染。在有條件的實驗室，要對每一（yī）批小牛血清（qīng）和長期傳代培養的細（xì）胞係進行支原體的檢查，查出汙染源應及時采取措施處理。對於汙染的雜交瘤細胞可以采取生物（wù）學的過濾（lǜ）方法，將汙染的（de）雜交瘤細胞（bāo）注射於BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，取出分（fèn）離雜交瘤細胞，一（yī）般可除去支原體汙染。

（2）融合（hé）後（hòu）雜交瘤不生長， 在保證融合（hé）技術沒有問題的（de）前提（tí）下（xià）主要考慮下列因素：

PEG有毒性或作用時間過長。

牛血清的（de）質量太差，用前沒（méi）有（yǒu）進行嚴格的篩選。

骨髓瘤細胞汙染了支原體。

HAT有問題，主（zhǔ）要是A含量過高或HT含量不足。

（3）雜交瘤細（xì）胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合後有細胞生長，但無抗體產生，可能是HAT中A失效或（huò）骨髓（suǐ）瘤細胞發生（shēng）突變，變成A抵抗細胞（bāo）所致。 有（yǒu）可能是免疫（yì）原抗（kàng）原性弱，免疫效果不好。 對於（yú）原分泌抗（kàng）體的雜交瘤細胞變為陰性，可能是細胞支原體汙染（rǎn），或非抗體分泌細胞克隆（lóng）競爭性生長（zhǎng），從而 抑製了抗體（tǐ）分泌細（xì）胞（bāo）的生長。也可能發生染色體丟失（shī）。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效（xiào）措施。

三要：

要大量保持和補（bǔ）充液氮凍存的細胞原管。

要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況（kuàng）。

要定期進行再克隆。

三不要：

不要讓細胞“過度生長”。因（yīn）為非分泌的雜（zá）交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的（de）雜交瘤（liú）細胞（bāo）。

不要讓（ràng）培（péi）養物不加檢查地（dì）任其連續培養幾周或幾個月。

不要不（bú）經克隆化而使雜交（jiāo）瘤在機體內以腫瘤生長形式連（lián）續傳好幾代（dài）。

（4）雜交瘤細胞難以克隆化

可（kě）能與小牛血（xuè）清（qīng）質量、雜交（jiāo）瘤細胞的活（huó）性狀（zhuàng）態有關，或由於細胞（bāo）有支原體（tǐ）汙染，使（shǐ）克（kè）隆（lóng）化難以成功。若是融合後的早期克隆化，應在培養液加（jiā）HT。

本文關鍵詞：單抗製備常見問題分析