一、目的（de）和內容

目的：學習從土壤中（zhōng）分離（lí）微（wēi）生物（wù）的方法,學習無菌操作技術.

內容：

1．用稀釋法分離細菌、放線菌和（hé）黴菌（jun1）.

2．用平（píng）板劃線方法分離微生物.

3．學（xué）習斜麵接種及穿刺（cì）接種等無菌操作技術.

二（èr）、材（cái）料和（hé）用具

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜麵菌種.

牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶,49.5mL無（wú）菌（jun1）水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無菌水（shuǐ）6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.

無菌培養皿12套,1mL無菌（jun1）移液管10支,土（tǔ）壤樣品及天平、稱量（liàng）紙、藥勺（sháo）、試管（guǎn）架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.

三、操作步（bù）驟

(一)土壤稀釋分離：

1、取土壤：取表層以下5—10cm處的土樣,放入無菌（jun1）的袋中備用,或放在4℃冰箱中暫存.

2、製（zhì）備稀釋液(要無菌操作)

(1)製備土（tǔ）壤懸液：

稱土樣0.5g,迅速倒入帶玻璃（lí）珠的49.5mL無菌（jun1）水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力（lì）最好),振（zhèn）蕩（dàng）5～10min,使土樣（yàng）充分打散,即成為10-2的土壤懸液.

(2)稀釋：

用無菌移液管吸10-2的土壤懸（xuán）液0.5mL,放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液,如此重複,可（kě）依次（cì）製成10-3～10-8的稀釋液(圖 3-1).注意：操作時管（guǎn）尖不能接（jiē）觸液（yè）麵,每一個稀釋度換用一支（zhī）移液管,每次吸入土液後,要將移液管插（chā）入（rù）液麵,吹吸3次,每次吸上的（de）液麵要高於前一次,以 減少稀（xī）釋中的誤差.

3、混（hún）菌法測定菌落數的方法

(1)細菌：取10-7、10-6兩管稀（xī）釋液（yè）各1mL,分別接人相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個（gè）平皿.然後取冷卻至50℃的（de）牛肉膏（gāo）瓊脂培養基,分別倒入以上培養（yǎng）皿（mǐn）中(裝量以鋪滿皿底（dǐ）高1.5～2mm為宜),迅速（sù）輕輕搖動平皿,使（shǐ）菌液與（yǔ）培 養基充分（fèn）混勻,但不沾濕皿的邊緣（yuán）,待（dài）瓊脂凝固（gù）即成細菌平板.倒平板時要注意無菌操作.

(2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液（yè）5～6滴,搖勻,靜置片刻,然後分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中,選用高氏1號培養基,用與細菌相同的方法倒入（rù）平皿中,便可製成放線菌（jun1）平板.

(3)黴菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別接入相應標號的平皿中,每個稀釋（shì）度接兩個平皿.在（zài）融化的土豆（dòu）蔗糖培養基中,每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕（qīng）輕搖勻,然後用與細菌相同（tóng）的（de）方法倒入平皿中,便可（kě）製成黴菌的平板.

4、培養：將接種好的細菌、放線菌、黴（méi）菌平板倒（dǎo）置,即皿蓋朝下放置,於28～30℃中恒溫培養,細（xì）菌培養1～2d,放線菌培養5～7d,黴菌培養3～5d.觀察（chá）生長的菌落,用於進一（yī）步純化分離或（huò）直接轉接斜麵.

(二)平板製作及（jí）劃線分離（lí）方法：

1．倒平板：按無菌操作要求,在火焰旁操作（zuò）,做法如3(1).

2．劃線分離：使用（yòng）接種環,從待純化的菌落或待分離的斜麵（miàn）菌（jun1）種隻沾取少量菌樣,在相應培養基平板中劃線分離,劃線的方法多（duō）樣,目的是獲得單個菌落,.

(三)斜麵接種和穿刺接種（zhǒng）：

1．斜麵接種

(1)取新鮮固體斜麵培養基,分別做好標記(寫（xiě）上菌名、接（jiē）種日期、接（jiē）種人等),然後（hòu）用無菌操作方法,把待接菌種接入以上新鮮培養（yǎng）基斜麵上.

(2)接種的方法是（shì）,用接種環沾取少（shǎo）量待接菌種,然後在新鮮斜麵（miàn）上（shàng）“之”字形劃線,方向是（shì）從（cóng）下部開始,一直劃至上部(圖3—4A).注意劃線要輕,不可把培養基劃破.

(3)接種後30℃ 恒溫培養,細菌培（péi）養48h,放線菌、黴菌培養至孢子成熟方可取出保存.

2．穿刺接種

(1)取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白腖柱狀（zhuàng）培養基,做好標記(寫上菌名)、接種（zhǒng）日期（qī）,接種人等).

(2)接種的方法是,用接種針沾取少（shǎo）量待接菌種（zhǒng）,然後從柱狀培養基的中心穿入其底部(但不要穿透),然後沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動.

(3)接種後30℃恒溫（wēn）培養, 24h後觀察,比較兩種菌的生長結果.

四、注意（yì）事項

1．一般土壤中,細菌最多,放線菌及黴菌次之,而酵母菌主要見於果園及（jí）菜園土壤中,故從土壤中分離細（xì）菌時,要取（qǔ）較高（gāo）的稀釋（shì）度,否則菌落連成一片（piàn）不能計數.

2．在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍（bèi）,最好更換一次移液管,使（shǐ）計數（shù）準確.

3．放線菌的培（péi）養時間較長,故製平板的培養基（jī）用量（liàng）可適當增多.

五、實驗結果

記錄（lù）土壤稀（xī）釋分離結果,並計算出每克土壤中的細菌、放線菌和黴菌的數量.

計算方法：選擇長出菌（jun1）落數30～300之間的培養皿進行計數,按（àn）以下公式：

總菌（jun1）數/g=同一稀釋度幾次重複的菌落平均數×稀釋倍（bèi）數

本（běn）文關鍵詞：土（tǔ）壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技（jì）術