1、傳代保存法：有些微生物當遇到（dào）冷凍或（huò）幹燥等處理時（shí），會很快死亡，因此在（zài）這種情況下，隻能求助於傳代培養保存法。傳代培養就是要定期（qī）地進行菌（jun1）種轉接、培養後再保存，它是最基本的微生（shēng）物保存法，例如酸（suān）奶等常用生產菌種的保存。

傳代保存時，培養（yǎng）基（jī）的濃度不宜過高，營養成分不宜過於豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的（de）範圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低於最適生長溫度為好。若（ruò）為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。

一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭（yàn）氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保（bǎo）存，而蕈類等大型食（shí）用菌的菌種則可以室溫直（zhí）接保存。

傳代培養保（bǎo）存法雖然簡便，但其缺點（diǎn）也（yě）很明顯，如（rú）：①菌種管棉塞經常容易發黴；②菌株的（de）遺傳性狀容易（yì）發生變異；③反複傳代時，菌株的病（bìng）原性、形成生理活性物質的能力以（yǐ）及形成孢（bāo）子的能力等（děng）均有降低（dī）；④需（xū）要定期轉種，工作（zuò）量（liàng）大；⑤雜菌的汙染機會（huì）較（jiào）多。          

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2、液體石（shí）蠟覆蓋保存（cún）法：該法較前一種方法保存菌種的時（shí）間更（gèng）長，適用於黴菌、酵母菌、放線（xiàn）菌及需氧（yǎng）細菌等的（de）保存。此法（fǎ）可防止幹燥，並通過限製氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法（fǎ）簡便的優點，同時也適（shì）用於不宜冷（lěng）凍幹燥的微生物（如產孢能力低的（de）絲狀（zhuàng）菌）的保（bǎo）存，而某些細菌如固氮菌、乳酸杆菌、明（míng）串珠菌、分枝杆菌、紅螺菌及沙（shā）門氏菌等和一些（xiē）真（zhēn）菌如卷（juàn）黴菌、小克（kè）銀漢黴、毛黴、根黴等不宜采（cǎi）用此法進行保存。

3、懸液保存法：即使微生物混懸於適當溶液中（zhōng）進行保存的方法（fǎ）。常用的有，

① 蒸餾水保（bǎo）存法：適用於（yú）黴菌、酵母菌及絕大部分放線菌（jun1），將其菌體懸浮（fú）於蒸餾水中即可在室溫（wēn）下保存數（shù）年。本法應注意避免水（shuǐ）分的蒸發。

② 糖液保存法：適用於酵母菌，如將其（qí）菌體（tǐ）懸（xuán）浮於10%的蔗糖溶液中，然後於冷暗處保存，可長達10年。除（chú）此之外，也可使用緩衝液或食鹽水等進行保存。

4、載體保存（cún）法：即將微生物吸附（fù）在適（shì）當載體（tǐ）上進行（háng）幹燥保存的（de）方法。常用的有方法包括以下（xià）幾種，如

① 土壤保存法：主要用（yòng）於能形成孢子或孢囊（náng）的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行幹燥或使菌（jun1）體繁殖後再幹燥（zào），然後冷藏或在室溫下密封保存。保（bǎo）存用（yòng）的土（tǔ）壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風幹、粉（fěn）碎、過（guò）篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖後進（jìn）行幹燥保存的方（fāng）法是：取適量土壤（5克）置（zhì）於塞有棉塞的試管中，加水或（huò）加入充分稀釋的液體培養基（以含水量為土壤最大持水量的60%為宜），然後高壓滅（miè）菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認（rèn）的程度為止，移入幹燥器中經短時間幹（gàn）燥或風幹後密封，冷藏或（huò）室（shì）溫保存。

② 砂土（tǔ）保存法：取清潔的砂，過（guò）60目（mù）篩去掉大砂粒，並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數（shù）次，幹燥後，置於試管（guǎn）或安瓶管中保（bǎo）持2～3cm深，再經幹熱滅（miè）菌後，加入1ml菌種培養液，經充分混勻後，放入真空幹燥器中，完全幹燥後熔封保存。也可用（yòng）二份洗淨的砂（經HCl預處理）和一份貧瘠、過（guò）篩的黃（huáng）土攙（chān）和後滅菌，再進行菌種（zhǒng）保藏。

③ 矽膠保存法：以（yǐ）6～16目的無色矽膠（jiāo）代替砂子，幹熱滅菌後（hòu），加入菌液。加菌液時，由於矽膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設（shè）法加以冷（lěng）卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素（sù）燒磁珠（或多孔玻璃珠）後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝（zhuāng）入1/2管高的矽膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經幹熱滅菌後，接入菌懸液，最後冷藏、室溫保藏或減（jiǎn）壓幹燥後密封保藏（cáng）。本法對酵母菌很有效，特別適用於（yú）根瘤菌，可保存長達兩年半時間（jiān）。

⑤ 麩（fū）皮保存法：在（zài）麩皮內加入60%的（de）水（shuǐ），經滅菌後接種培養，最後幹燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅（miè）菌紙片浸入培養液或菌（jun1）懸液中（zhōng），常（cháng）壓（yā）或（huò）減壓（yā）幹燥後，置於裝有幹燥劑的容器內進行（háng）保存。

5、寄主（zhǔ）保（bǎo）存法：即令微生物侵入其（qí）寄主後加以保存（cún）的方法（fǎ）。

6、冷凍保存法：適用於抗凍力強的微生物（wù）。這些微生物（wù）可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而（ér）對（duì）其它大多數微生物（wù）而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時（shí），應注意以下（xià）幾點，

① 要選（xuǎn）擇適於冷凍幹燥的菌齡細胞；

② 要選擇（zé）適宜的培養基，因為某（mǒu）些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示（shì）出巨大差異；

③ 要選擇合適（shì）的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也（yě）越長；

④ 最好在菌液（yè）內不添加（jiā）電解（jiě）質（zhì）（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液（yè）內添加甘油等保護劑，以（yǐ）防止在冷（lěng）凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣（yàng），也可添加各種糖類（lèi）、去纖維（wéi）血液和脫脂牛乳等具有（yǒu）良好保（bǎo）護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入（rù）保護劑時，可靜置一段（duàn）時間後再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應在－20℃範圍（wéi）內以1℃/min左右的（de）速度緩慢降溫，此後必須盡快降（jiàng）到貯藏溫（wēn）度；而對絕大多數微生物而言（yán），則（zé）不必如此，如結構較為複雜的原（yuán）蟲則可在－35℃範圍內進行緩慢降溫，而噬（shì）菌體則必（bì）需采用上述（shù）的二（èr）階段（duàn）法進行冷凍；

⑧ 若進行長期保（bǎo）存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存（cún）的菌種（zhǒng）時，應采取速（sù）融措施，即在35～40℃溫水中輕（qīng）輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化後，應盡量（liàng）避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

常用的（de）冷凍保存法包括：

① 低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫（wēn）冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外（wài）包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然後（hòu）把玻（bō）璃珠置於塑（sù）料容器內，再放入低溫冰箱（xiāng）內進行保存的。

② 幹冰保存法（－70℃左右）：即將（jiāng）菌種管插入幹冰內，再置於冰箱內進行冷凍保存。

③ 液氮保存法（fǎ）（－196℃）：是適用範圍最廣的微生物保存法。其操作步（bù）驟如下，

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的（de）菌體懸浮於含有適（shì）當防凍劑（保存黴菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將（jiāng）0.2～1ml的這種（zhǒng）溶液分裝於安瓶（píng）中，或在裝（zhuāng）有分散劑（jì）的安瓶（píng）中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮於分散劑中（zhōng）。

b、熔封安瓶管：若直接貯存於氣相液氮中（－150℃～－170℃）時，則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將（jiāng）熔（róng）封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鍾後，觀察有無色素進入（rù）安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置於小罐中，然後用（yòng）液氮氣以（yǐ）約1℃/min的速度冷卻至－25℃左（zuǒ）右，也（yě）可在－20℃～－25℃的冰箱內緩慢冷（lěng）卻30～60min。

e、速冷：最後浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

7、冷凍幹燥保存法：其原理是首先（xiān）將（jiāng）微生物冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水

分。事實上，從菌體中除去大部分水分後，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到（dào）長（zhǎng）期維持（chí）生命狀態的（de）目（mù）的。該方法適用於（yú）絕大多數微生物菌種（包括噬菌（jun1）體和立克次氏體等）的保存，其過程如圖6-1所示。

在進行冷凍幹燥時，需注意以下幾個問題：

a、冷凍幹燥前的培養條件：首（shǒu）先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養豐富且容易（yì）增菌的培養基上進行（háng）培養為宜；菌齡以達到對數生長期為好；若為有芽孢或孢子的（de）微生物，則以芽孢和孢子形成以後進行保存為好；菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/ml。

b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側（cè）標記或在安瓶內封入標簽。

c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水衝洗3次後，蒸餾水刷淨，幹燥，塞棉塞，貼標簽，幹熱滅菌或溫熱滅菌後，60℃恒溫幹燥。

d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂（zhī）乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

8、Bordelli氏法：取幹（gàn）淨的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌（jun1）。用滅菌的脫（tuō）脂牛乳洗脫試（shì）管斜麵上（shàng）的菌苔，製成濃厚菌懸液。然後用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然後轉動小試管使菌液分（fèn）散在（zài）試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在（zài）15×150mm的試管中，在大試管底部事（shì）先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻（bō）璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試（shì）管與真空泵連通，抽真（zhēn）空至0.1～0.2mm汞柱時，將（jiāng）玻璃管熔（róng）封，置室溫暗處或（huò）冰箱保存。

本（běn）文關鍵詞：菌株的保藏方法