一.    石蠟切片在染（rǎn）色過程（chéng）中出現脫片現象？

一般來說，如果用多聚賴氨酸包被過的片子做正常免疫組織化學染色的話是不會掉片子的。但（dàn）如果要做抗原修複的（de）話，如果片子處理（lǐ）不好的（de）話是有可能掉片子（zǐ）的。你可以試試一下的方（fāng）法：

1.一般用APES：丙酮=1:50的處理（lǐ）液來處理片子，處理5min左右，然後水洗（xǐ），烘幹既可用（yòng）於貼片。如果把水滴再處理好的片子上，水比較聚的話說明片子處理（lǐ）的（de）好（hǎo）。

2.貼片子的時候，展片的時間要把握好，不要太長，否則不利於貼牢。

3.烤片子也很重要，切好的（de）片子最好先（xiān）不要馬上（shàng）收起來，而是水平至於烘片（piàn）台上37度兩個（gè）小（xiǎo）時以上，一是水分（fèn）徹底（dǐ）烘幹。然（rán）後做染（rǎn）色前最好再在60度烘箱烘1個小（xiǎo）時。

4.再補充一點 ，石蠟包埋（mái）時，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點要充分，這（zhè）對貼片也有影響。

如果這些導致掉片的因素（sù）都已經排除但是片子還是掉的厲害，那麽也可能是以下原因造成的：

1、多（duō）聚賴氨酸玻片質量的（de）問題。我原（yuán）先（xiān）是買的，邁新按說也是不錯（cuò）的，可是都脫成什麽樣子了。後麵補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。

2、組織切的不好（hǎo），切片機的問題例如（rú）比較老的舊的機器切的厚或者（zhě）不均勻，或者（zhě）切片者手法不（bú）好等。

3、組織的問題，我用的組織癌（ái）症的很多，越（yuè）是癌症組織有壞死之類越容易脫（tuō）。

4、沒烤好，時間短溫度不夠之類。

5、操作的時候甩的太猛了（le），有脫（tuō）片嫌疑的片子最好不甩或輕（qīng）輕甩，用衛生紙從邊（biān）緣上慢（màn）慢（màn）吸水。

6、修複的問題：抗原修複的（de）時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複（fù）液時手法不好，咚的一聲就丟進去（qù）了，這樣超容（róng）易脫片。此外，用EDTA修複比檸檬（méng）酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，隻有從另外的問題上（shàng）著手。

此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用（yòng）PBS的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵（miàn）都注意到了，能改善的盡量改善（shàn），脫片可以減少很多。

二. DAB顯色（sè）後（hòu）發現（xiàn）切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

著色不均勻可能與你（nǐ）的實驗手法有很大關係，可能原因有：

1.切出的片（piàn）子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著（zhe）色深淺不一。

2.有（yǒu）可能是（shì）你 顯色（sè）液底物（wù）加到片子上後沒有搖勻，造成（chéng）局部底物濃度不一致，所以加完顯色液後最（zuì）好將片子來回左（zuǒ）右晃動幾下，使片子上所有（yǒu）區域（yù）的底物濃度一致。

3.如果你的（de）片子是中（zhōng）間的染色深，靠近邊（biān）上的淺（qiǎn），那（nà）有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的麵積不過大（dà）而產生了邊緣效應（yīng）。最外側的組織片最（zuì）好離顯色液外緣0.5cm。

三. 切片染色後背景太深，不易區分特異（yì）性與非特異性著色？

a.也許是（shì）抗體本身有問題，因為有（yǒu）很多公司的抗體質量並不好，很容易上背景，可以換一種抗體 試試。

b.如果經費不（bú）允許換抗體的話，你可降低抗（kàng）體的濃度，並隨時注意觀察顯色，在能看到信號的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說，會有不同的封閉效果。

d.可以（yǐ）在（zài）一抗和二抗中加入一定比例的（de）你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

全片著色

全片著色是（shì）指整個（gè）切片全都染上了（le）顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清（qīng）那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因（yīn）有：

（1）抗體濃（nóng）度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新（xīn）抗體前應當（dāng）對其工（gōng）作濃（nóng）度進行測試，使每一抗體個體化，找（zhǎo）到適合自己實驗室（shì）的理想工作濃度，既（jì）使是（shì）即用型的抗體也應如此，不能隻簡單的按說明書進行染色。

（2）抗（kàng）體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴（yán）格執行操（cāo）作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間（jiān）延長（zhǎng）。現（xiàn）在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一（yī）抗孵育的時間不是傳統的1小時，而（ér）是30分鍾，因（yīn）此，要根據染色結果進行調整（zhěng）。

（3）DAB變質和顯色時（shí）間太長（zhǎng）：DAB最好現（xiàn）用現配，如有沉渣應進行過濾後（hòu）再用。配製好的DAB不應存放（fàng）時間太長，因為在沒有酶（méi）的情況下，過氧化氫也會 遊（yóu）離出 氧（yǎng）原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的（de）辦法是不可取的（de）。DAB的（de）顯色最（zuì）好在顯微鏡下監控，達到（dào） 理想的染色程度時（shí）立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似（sì）乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。

（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失（shī）等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認（rèn）真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的（de）避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在（zài）緩衝液或修複液中浸泡時間太長（zhǎng）（大（dà）於24小時）：原（yuán）因上（shàng）不清楚，但現象存在。有的實驗（yàn）室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第（dì）二天加抗體進行免疫組 化染 色（sè），如果將裝有切片和修複液的容器（qì）放在4?C冰（bīng）箱過夜（yè），對結果（guǒ）無明顯影（yǐng）響（xiǎng），如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太（tài） 長。

（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注（zhù）意抗體的（de）有效期，過期的抗體要麽（me）不顯色要麽背景著色。用新買的抗（kàng）體時最好設立陽（yáng）性對照和用使（shǐ）用（yòng）過的抗體作（zuò）比較。

四. 免（miǎn）疫組化結果老是出現（xiàn）陰性結果？

免疫組化出現陰性結果（guǒ）有可能組織本身（shēn）就沒有信號，也有可能是抗體出（chū）了問題。可以找（zhǎo）一些陽性組（zǔ）織做（zuò）一下，以確定是抗體的問題還是組織本身就沒有所（suǒ）檢測的抗原（yuán）表達。還有，可以（yǐ）提高抗體的濃度（dù），或者試一試抗原修複等方法，也許會得（dé）到意想（xiǎng）不到的結果。

五. 一抗從（cóng）4度拿出後，為什麽有人說要37度複溫，目的（de）是什麽？

1. 一方麵，防止切片從4度直接放入PBS易（yì）脫片；

2. 另一方麵，使抗原抗體結合更穩（wěn）定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用（yòng）,4度和37度時分子運動（dòng）方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小於後者,後者結合更快,但（dàn）敏感性也提高了並易造成（chéng）非特異（yì）染色。

六. 免疫組化中抗原修（xiū）複（fù）的（de）最佳條件是什麽？尤其是微波修複。

關於（yú）抗原修複，我（wǒ）個人的（de）觀點和panther75有點不同（tóng）。我試（shì）過的修複（fù）條件有EDTA熱修複，檸檬酸鈉（nà）為緩衝（chōng）液的微波修複以及高（gāo）壓鍋修複。從我的實驗結果 來看，微波修複其實很不容（róng）易掉片子的，而EDTA熱修複和高壓鍋修複是很容易掉片子的。因（yīn）為掉片子主要是因為加熱過程中產生的氣泡所引起，而微波修複水加（jiā） 熱到沸騰，沾在（zài）片子上的氣泡就（jiù）會少，不會因為小氣（qì）泡上串引起脫片。做EDTA修複（fù）時（shí），你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什麽（me）的（de），然後蓋 上蓋玻片，這樣修複（fù）的話就能夠盡量減少（shǎo）載玻片上小氣泡（pào）的形成（chéng）。

我（wǒ）們用的微波修（xiū）複條件為：

2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水，調ph值（zhí）至6.0，微波修複10分鍾。你可（kě）以試試，時間可以根（gēn）據需要自己調整。

七. 有人在一抗孵育前用（yòng）tritonX100來（lái）通透細胞，對（duì）石蠟切片需要否？

用（yòng）石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的，一是因為石蠟切片比較薄，另外一個（gè）原因（yīn）我認為（wéi）是在包埋過程（chéng）中細胞膜已經被破壞，所以這一步可以省略。

八. 蘇木素複染的時（shí）間應（yīng）該是多（duō）少（shǎo）？複染過度咋辦？

複染時間不需要太長，當然這也要根據蘇木精的質量來確定，但基本上不（bú）要超多一分鍾。染色（sè）過深的話可以（yǐ）用酸性的水溶液（在水裏滴加少（shǎo）量濃鹽酸（suān））分色，分色（sè）的另 外一個（gè）目的是洗掉蘇木（mù）精在細胞質中的非特異（yì）性結合，這樣可（kě）以使細胞質中的特異信號更明顯。所以（yǐ）不管複染是不是過度，分色這一步最好（hǎo）不（bú）要省掉。分色後記得再 用氨水返（fǎn）藍一下。

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