1、純化的一般目標和（hé）方法

首（shǒu）先，自然來源或者重組表（biǎo）達的蛋白質經過一些粗提的步驟(例如（rú）：勻漿、離心（xīn）、硫酸銨沉澱等)成為穩（wěn）定的可以用於色譜分離的樣品。

然後進行捕獲色（sè）譜(capture chromatography)，主要目標是濃縮和去除大量的容易去除的雜質（zhì），此步最關心（xīn）的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。

經過濃縮的部分純化的樣品進行中級色譜（pǔ）(intermediate chromatography)，目的（de）是去除（chú）較難（nán）去除的雜質，此步（bù）最關心的是（shì）分辨率，常采用高分辨率的細（xì）顆粒凝膠。

最（zuì）後為了（le）得到符合要求的最終產品，去除殘存的雜質以及目的蛋白的（de）多聚物或者降解片斷，進行精製色譜(polishing chromatography)，常采用具有（yǒu）高分辨率的凝膠過濾（lǜ）凝膠進行凝膠（jiāo）過濾色譜。

2、純化（huà）前的（de）準（zhǔn）備工作

(1)樣品（pǐn）穩定（dìng）性試驗a、測定樣品在pH 2-9的穩（wěn）定性；b、測定樣品（pǐn）在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸（suān）銨中的穩定性；c、測定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩（wěn）定（dìng）性（xìng）；d、測定（dìng）樣品在4-40℃的穩定性；e、室溫下靜置過（guò）夜，測定對蛋白水解酶的穩定性。

(2)樣品預處（chù）理a、去除樣品中顆粒物(0.45-0.22微（wēi）米膜過濾或者10000 g離心15分鍾（zhōng）)

b、去除樣（yàng）品（pǐn）中脂類( 10000 g離心15分鍾或有機溶劑抽提)

c、去除樣品中核（hé）酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉澱)

d、抑製（zhì）樣品中（zhōng）蛋白水解酶(加入蛋（dàn）白酶（méi）抑製劑、低溫下快速第一（yī）步分離（lí）或在蛋白酶缺陷宿主中表達重組蛋白)

(3)樣品（pǐn）的保存條件：短期儲存(小（xiǎo）於24小時)

a、避免接近或超過（guò）樣品的穩定極限防止蛋白質變性或沉澱b、在密閉容器（qì）中冰箱冷藏較長期儲（chǔ）存（cún）(數天)

a、b、同上c、加入適當的（de）抑菌劑長期儲存a、同上b、冰凍或者最好（hǎo）凍幹（gàn）(真空冷凍（dòng）幹燥)保存。

3、對每一純化步驟的評價（jià）相關方（fāng）法的建立

a、目的蛋白含量測定（dìng）酶活性（xìng）測定、生物活性測定、放射免疫、酶聯免疫、免疫電泳、熒（yíng）光。

b、總蛋白含（hán）量測定紫外吸收法、Lowry法（fǎ）、Bradford染料結合法(考馬（mǎ）斯亮蘭G-250)等。

c、樣品（pǐn）複（fù）雜度檢測HPLC(離子（zǐ）交換、凝膠過濾（lǜ）、反相)、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳(CE)。

4、蛋白質的來源

(1)天然蛋（dàn）白： 天然產物中（zhōng）的目的蛋白一般含（hán）量很少而且（qiě）組分極複雜，在分離過程中須采用多步驟才能去除各種雜質，並應在整個過程中（zhōng）降低蛋白水解酶的活性。

(2)重（chóng）組蛋（dàn）白： 重組蛋白則目標蛋白（bái）的豐度較高（gāo）。重組蛋白（bái）主要有三（sān）種表達定位：

a、細胞質：在種情況下，必須破壞細胞結構才能得到目的蛋白質，同時伴隨著大量核酸和（hé）其它上千種宿主（zhǔ）蛋白質的釋放；在（zài）表達（dá）量較高的條件下，一般形成包涵體，包涵體含有過表達目的蛋白（bái），且容易通過高速離心分（fèn）離，但是包涵體（tǐ）的溶解與複性（xìng）是較複雜的。

b、外周質： 表達的蛋（dàn）白質（zhì）存在於細菌內膜（mó）與外膜之間，這樣目的蛋白（bái）可（kě）以較少地受到蛋白酶的作用並減少了宿主蛋白的汙染（rǎn）。

c、分泌（mì）到培養基：這種表達一般（bān）蛋白質濃度較低，主（zhǔ）要受到培養基中的汙染。

本文關鍵詞：蛋白質、多肽液（yè）相色譜（pǔ）純化