一.    石蠟切片在染（rǎn）色過程中出現脫片現象？

一般來說，如（rú）果（guǒ）用多聚賴氨酸包被過的片子做正常免（miǎn）疫組織化學染色的話是不會掉片子的。但如果要做抗原修（xiū）複的話，如果片子處理不好的話（huà）是有可能掉片子的。你可以試試一下的方法：

1.一般用APES：丙（bǐng）酮=1:50的處理液來處（chù）理（lǐ）片子，處理5min左右，然後水洗，烘幹既可用（yòng）於（yú）貼片。如果把水滴再處理好的片子上，水比較（jiào）聚的（de）話說明片子處理的好。

2.貼（tiē）片子的時（shí）候，展（zhǎn）片的時間要把握好，不要太（tài）長，否則不利於貼牢。

3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要馬上（shàng）收起來（lái），而是水平至於烘片台上37度（dù）兩個（gè）小時以上，一是水分徹底烘幹。然後做染色前最好再在60度烘箱烘1個小時。

4.再補充一點 ，石蠟包埋時，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點（diǎn）要充分，這（zhè）對貼片也有影（yǐng）響。

如果這些導致掉（diào）片的（de）因素都（dōu）已（yǐ）經排除但是（shì）片子（zǐ）還是掉的厲害（hài），那麽也可（kě）能是以下原因造成（chéng）的：

1、多聚賴氨酸（suān）玻片質（zhì）量的問題。我原先是買的，邁（mài）新按說也是不錯的，可是（shì）都脫成什（shí）麽樣子了。後麵補做第二（èr）批時用的病理科老師（shī）自己做的片子，要好一點。

2、組織（zhī）切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切（qiē）的（de）厚或者不均勻，或者切片者手法不（bú）好等。

3、組織（zhī）的問題，我用的組織（zhī）癌症（zhèng）的很多，越是癌症組織（zhī）有壞死之類越容易脫。

4、沒烤好，時間短溫度不夠之（zhī）類。

5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不（bú）甩（shuǎi）或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢（màn）慢吸水。

6、修複的問（wèn）題：抗原（yuán）修複的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複液（yè）時手法不好，咚的一聲就丟進去（qù）了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修（xiū）複（fù）比檸檬酸容（róng）易脫片，但是你（nǐ）要用到EDTA的時候也（yě）沒（méi）辦法，隻有從另外（wài）的問（wèn）題上著手。

此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不（bú）要衝。基本上把這些方麵都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可（kě）以（yǐ）減（jiǎn）少很多。

二. DAB顯色（sè）後發現切（qiē）片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

著色不均勻（yún）可能（néng）與你的實驗（yàn）手法有很大關係，可能原因有：

1.切出的片子厚度本（běn）身可能就不一樣，切出一片厚，一（yī）片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2.有可能是你 顯（xiǎn）色液底物加到片（piàn）子上後沒有搖勻，造成局部（bù）底物（wù）濃度不一（yī）致，所以加完顯色液後最好將片子（zǐ）來回左右晃動幾下，使片子（zǐ）上所有區域的（de）底物濃度一致。

3.如果你的片子是中間的染（rǎn）色（sè）深，靠近邊上的淺，那有可能是你（nǐ）蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的麵（miàn）積不過大而產生了邊緣效應。最外側的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。

三. 切片染色後背景（jǐng）太深，不易區分特（tè）異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問題，因為有（yǒu）很（hěn）多公司（sī）的抗體（tǐ）質量並不好，很容（róng）易上背景，可以換一種抗（kàng）體 試試。

b.如果經費（fèi）不允許換抗體的話，你（nǐ）可降低抗體的濃度，並隨時注意觀察顯色，在（zài）能看到信號的情況下盡量降低（dī）背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封（fēng）閉液對某種（zhǒng）來源的抗體來說（shuō），會有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和（hé）二抗中加入（rù）一定比（bǐ）例的（de）你（nǐ）所檢（jiǎn）測動物組織（zhī）的正常血清，這樣可以（yǐ）去除一部分（fèn）非特異性染色（sè）。

全片著色

全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的（de）強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織（zhī）是陰性。出現這種現象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗濃（nóng）度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試（shì），使每一抗（kàng）體個（gè）體化，找到適合自己（jǐ）實驗室的理想工作濃度，既使（shǐ）是即用型的抗體也（yě）應如此，不能隻簡單（dān）的按說明（míng）書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或（huò）溫（wēn）度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程（chéng），最好隨身佩帶（dài）報時表或報時（shí）鍾，及時提（tí）醒，避免因遺忘而造成時間延長（zhǎng）。現（xiàn）在流行的二步法（Polymer）敏（mǐn）感性很高，要求一抗（kàng）孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾，因（yīn）此（cǐ），要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用（yòng）現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間（jiān）太長，因為在沒有（yǒu）酶的情（qíng）況下，過氧化氫也會 遊離出 氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦（bàn）法是不可取的。DAB的顯色最好（hǎo）在顯微鏡下監（jiān）控，達到 理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用（yòng）染色機時，這（zhè）樣做（zuò）似乎不現實，但至少應對一（yī）些新的或少用的抗體顯（xiǎn）色時進行（háng）監控，避（bì）免顯色時間過長。

（4）組（zǔ）織變幹：修複液溢出後（hòu）未及時補（bǔ）充（chōng）液體（tǐ）、染色切片太多、動作（zuò）太慢（màn）、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織（zhī）變幹（gàn）的原因（yīn）。解決的辦法是操作（zuò）要（yào）認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周（zhōu）圍畫圈，可（kě）以有效的（de）避免液體流失（shī），也（yě）能提高操（cāo）作速度。

（5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太（tài）長（大（dà）於24小時）：原因上不（bú）清楚，但現象（xiàng）存在。有的（de）實驗（yàn）室喜歡前（qián）一天將切片脫蠟至修複，第二天（tiān）加抗體進行免疫組 化染 色，如果將裝有切片和修（xiū）複液的容器放在4?C冰箱過夜，對結果無明顯影（yǐng）響，如果（guǒ）放在室溫，特別是炎（yán）熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太 長。

（6）一抗變（biàn）質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著（zhe）色。用新買的抗體時最（zuì）好（hǎo）設立陽（yáng）性對照和用使用過的抗體作比較。

四（sì）. 免疫組（zǔ）化結果老是（shì）出現陰性結果？

免疫組化出現陰性結果有（yǒu）可能組織本身就沒有信號，也有可能是抗體（tǐ）出了（le）問題。可以找一些陽性組織做一下，以確定（dìng）是抗體的問題還是組織本（běn）身就沒有所檢測的抗原表達。還有，可以提高抗體的濃度，或者試一試抗原修複等方法，也許（xǔ）會得到（dào）意想不到的結果。

五. 一抗從4度拿出後，為什麽（me）有人說要37度複溫，目的是什麽？

1. 一方麵，防止切片從4度直接放入PBS易脫（tuō）片（piàn）；

2. 另（lìng）一方（fāng）麵，使抗（kàng）原抗體結合更穩定。一（yī）般不需要,但對（duì）表達較弱的抗原可能（néng）有用,4度和37度時（shí）分子運動方式不同,前者分（fèn）子（zǐ）碰撞機率和運（yùn）動速度小於後者,後者結合（hé）更快,但敏感性也提高了並易造成非特異染色。

六. 免疫組化中抗原修（xiū）複的最佳條件是什麽？尤其是微波修複。

關於抗原修複，我個人（rén）的（de）觀（guān）點和panther75有點不同。我試過的修複條件有EDTA熱修複（fù），檸檬酸鈉（nà）為（wéi）緩衝液的微波修複以及（jí）高壓鍋（guō）修複。從我的實驗結果 來看，微波修複其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修（xiū）複和高壓鍋修複是很容易掉片子（zǐ）的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產生的氣泡所引起，而微（wēi）波修複水（shuǐ）加 熱到沸騰（téng），沾在片子上的氣泡就（jiù）會少，不會（huì）因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修複時，你可以將片子靠的盡量（liàng）近些（xiē），或是在載玻片四周墊些棉花什麽的（de），然後蓋 上蓋玻片，這樣修（xiū）複的話就能夠盡（jìn）量（liàng）減少載玻片上小氣泡的形成。

91视频网站入口用的微波修複條（tiáo）件為：

2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水，調ph值至（zhì）6.0，微波修複10分鍾。你可以試試，時間可以根（gēn）據需要自己調整。

七. 有人在一抗孵育（yù）前用tritonX100來通（tōng）透細胞，對石蠟切片需（xū）要否？

用石蠟切片（piàn）做免疫組化是（shì）不需要透膜處理的，一是因為石蠟切片比較薄，另外一個原因我認為是在包埋過（guò）程中細胞膜已經被（bèi）破壞，所（suǒ）以這一步可以省略。

八. 蘇木素複染的時間應該（gāi）是多少？複染過度咋辦？

複染時間不需要太長，當然這（zhè）也要根據蘇木精的質量來（lái）確定，但基本上（shàng）不要超多一分鍾（zhōng）。染色過深（shēn）的話可以（yǐ）用酸（suān）性的水溶液（在水裏滴加少量濃鹽酸）分色，分色的（de）另 外一個目的是洗掉蘇木（mù）精在細胞質中的非特異性結合，這樣可（kě）以使細胞質中的特（tè）異信號更明顯。所以不管複（fù）染是不是過度，分色這一步（bù）最好不要省掉。分色後記得再（zài） 用氨（ān）水返藍（lán）一下。

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